树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗领域的研究现状

1、树突状细胞疫苗在肿瘤免疫治疗领域的研究现状潘春华综述罗荣城审校(第一军医大学附属南方医院肿瘤科,广州510515中国图书分类号R73013文献标识码A文章编号10002484X(20031020732204树突状细胞(Dendritic Cells,DC是目前所知的功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(Native T cell的专职抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC,具有强大的激活C D8+CT L及C D4+T辅助细胞的能力,控制着体内免疫反应的过程,在免疫应答中处于中心地位,因而成为肿瘤免疫反应的中心环节。DC可以在体外培养后用于体内免疫治疗,也可辅

2、以细胞因子或其它因子如Flt23等在体内扩增1。用DC疫苗进行抗肿瘤治疗已受到重视2,3,且成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的热点课题,对树突状细胞疫苗的研究日趋深入而广泛。1树突状细胞及其生物学特征DC最初是Steinman和C ohn等1973年从小鼠的脾组织中分离发现的,因其形态具有树突样或伪足样突起而命名。DC细胞种类繁多,但其共同特征是,具有典型的树突状形态、膜表面高表达MHC2类分子及C D80+、C D86+等共刺激分子、活化C D4+及C D8+T淋巴细胞、刺激雏型T淋巴细胞增殖活化、诱导特产生异样CT L及免疫应答。在外周血中含量约为白细胞总数的1%,分为髓系DC和淋巴系DC

3、两大类,主要来自髓系。非成熟DC参与抗原的摄取、加工和处理,而成熟的DC则参与抗原的递呈及活化T细胞,提呈抗原能力是巨噬细胞和B细胞的1001000倍,是体内唯一的职业抗原提呈细胞。来自血液的雏形淋巴细胞经过内皮细胞微静脉进入淋巴组织,DC、滤泡型DC、B细胞及T淋巴细胞共同聚集在滤泡区的生发中心参与抗体形成。之后经输出淋巴管进入T细胞聚集区,最后死亡。类浆细胞亚群DC从血液直接进入T细胞区,其生命周期仍不清楚(图14。DC疫苗有一些特化作用,抗原捕获、MHC复合体的形成及T细胞刺激作用。DC表达多种受体,其天然配体仍未探知,因此,抗受体的抗体常用作替代作者简介:潘春华(1968年-,女,博士

4、研究生,主治医师,从事肿瘤生物治疗及基因治疗的研究;指导教师:罗荣城(1958年-,男,硕士,博士生导师,主任医师,从事肿瘤生物治疗及基因治疗的研究。抗原。几种受体是型跨膜蛋白,具有单一的外部C型植物凝血素区。FcR介导提呈MHC2类抗原的外源途径。DC还表达高水平的选择性T LRs,从而当受微生物刺激后成熟。在成熟的过程中,DC产生并表达高水平的共刺激分子以促进T细胞增殖分化(图24。透射电镜下可见DC伸展的突起,胞浆中富含线粒体,溶酶体较少。在扫描电镜下可见胞体突起形成不规则形态,细胞表面微绒毛消失,表面粗糙,层叠状雏襞明显。树突状突起粗、长,易观察(图3。2DC的来源及体外培养由于自体免

5、疫细胞与异体树突状细胞之间由于存在着人类白细胞抗原(H LA,如果基因型不相合会引起强烈的排斥反应,且受体内的T细胞不能识别供者树突状细胞上非匹配的H LA分子,无法诱导有效的CT L的增殖及抗肿瘤作用,因而必须是自体的树突状细胞才能作为肿瘤疫苗的负载体用于临床抗肿瘤治疗。目前用作瘤苗的树突状细胞来源有:骨髓、外周血和新生儿脐带血。3DC疫苗的种类目前,DC介导的疫苗主要有三大类:肿瘤抗原肽修饰的DC;细胞性肿瘤抗原修饰的DC;肿瘤抗原及细胞因子基因转染的DC,具体研究及应用将在各具体疾病中详细讨论,现仅概述如下 。图1树突细胞和淋巴细胞的循环Fig.1DC circulations and

6、lymphocyte 图2树突细胞捕获抗原、形成MH C 多胎复合物和刺激T 细胞的特化作用Fig.2Some specializations of DCs for vaccine capture ,MH C 2peptide complex form ation ,and T cellstimulation 图3扫描电镜下观察到的DC 细胞的形态(×5000Fig.3Morphology of DC observed by electron microscopy(×5000311肿瘤抗原肽修饰的DC 动物模型及人体临床试验已证明,肿瘤抗原肽(包括合成肽或肿瘤细胞相关抗原与

7、自身或同种异体的DC 共育,DC 与肿瘤表位肽结合之后可激发抗肿瘤CT L 有效的抗肿瘤免疫,将DC 回输给机体,可预防肿瘤播散、复发及治疗肿瘤。可用作瘤苗的抗原肽有肿瘤抗原、分化抗原、肿瘤独特型抗体、癌基因及抑癌基因产物、粘蛋白等。用负载肿瘤表位肽的DC 免疫小鼠,可使具有同表位肽的肿瘤消退及抵抗致死剂量肿瘤细胞的攻击。与此同时,该类肿瘤的其它表位肽亦受攻击,这种现象称为表位扩展(epitope spreading 。德国学者用负载Her2neu75肽或M UC1M1肽的DC 疫苗治疗乳腺癌和卵巢癌5,在10例中有5例体内检测到了肽特异性CT L ,且持续6个月以上,1例病人经几次M UC1

8、肽DC 疫苗免疫后,检测到了CE A 和M AGE 3肽特性T 细胞反应,另1例病人用Her2neu75肽DC 疫苗治疗7次后,检测到了M UC1肽特异性T 细胞反应,预示用单一抗原成功免疫后在体内也可出现抗原的扩展,这一结果对今后应用其它肽DC 疫苗治疗肿瘤有一定的指导作用。另外,应用肿瘤抗原MHC 2类多肽冲击树突状细胞,可提高肿瘤抗原浓度及其靶向性。利用弱酸洗脱法可获得肿瘤细胞表面的MHC 2类抗原肽,试用于临床也收到较好疗效6。朱学军等用该法提取的肿瘤抗原肽致敏DC 治疗荷瘤小鼠也取得了较好的疗效7。由于弱酸可以洗脱绝大部分肿瘤细胞表面与MHC 2类分子结合的多肽,对于那些MHC 2类

9、分子表达阳性的肿瘤,提供了一个较好的肿瘤抗原肽的来源,有希望用于临床。G abrilovich 等用突变的P53多肽致敏DC 而制备的DC 疫苗可延长携带人突变P53基因的荷瘤小鼠的生存时间8。肿瘤抗原肽致敏的DC 疫苗虽有上述优点,但也存在如下不足之处:难以确定最佳刺激剂量、抗原成分复杂、含有自身正常抗原、易诱发自身免性疾病等危险。312细胞性肿瘤抗原修饰的DC 由于目前肿瘤特异性抗原或相关性抗原得到明确鉴定的为数甚少,因而予以瘤细胞全部抗原信息(如肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞提取物、肿瘤细胞的总RNA 或经过灭活的完整的肿瘤细胞修饰DC 成为必要。基于细胞性肿瘤抗原易于获取和制备,因而应用全细

10、胞性肿瘤抗原冲击致敏DC 的方法来制备DC 疫苗不失为一种简便而有实效的方法,有较大的临床应用潜力。近年来,有人用肿瘤细胞与DC 融合的方法制备DC 疫苗。范国昌等用人树突状细胞与人白血病细胞K 562融合诱导出P210蛋白特异性的CT 9。由此提示,肿瘤细胞与DC 融合是制备DC 疫苗的又一方法。不足之处:所需要的瘤细胞数量多;非相关抗原量大且种类多,易诱发自身免疫病;所用的抗原多肽不一定能诱导最佳的抗肿瘤免疫反应,如因抗原调变、抗原脱失或抗原的低免疫原性等原因;刺激剂量难以确定。313肿瘤抗原基因转染的DC疫苗基于DC的基因疫苗有:转染肿瘤抗原的RNA的DC疫苗、转染肿瘤抗原DNA的DC疫

11、苗以及转染细胞因子基因的DC疫苗等。由于大部分肿瘤患者的瘤细胞的抗原的基因信息以及编码的抗原不明确,或缺乏足够的瘤组织而无法用抗原肽负载DC的方法制备DC瘤苗,而使患者失去治疗机会10。分子生物学的发展使核酸扩增成为可能,肿瘤抗原RNA或相应的cD2 NA文库为肿瘤抗原的来源提供了方法。通过核酸扩增、差异筛选等方法获得足够的肿瘤细胞特异性mRNA,从而解决疫苗制备时肿瘤细胞来源困难及其特异性问题,避免诱发自身免疫性疾病的危险。同时经基因转染树突状细胞可持续表达肿瘤抗原,避免了前两种疫苗因抗原解离或降解而影响其功能的不足。Nair等发现用编码CE A抗原的RNA转染的人DC在体外能诱发强而有力的

12、CT L反应11。但是目前这种技术尚不很成熟。尽管基因转导的结果令人鼓舞,但基于花费高及缺乏方便性,其商业可行性值得考虑,安全性更是不容忽视的问题。因而针对上述要求,脂质体联合组织特异性基因表达系统似乎可以满足条件12。曹雪涛等还将重组腺病毒介导的G M2CSF基因转染树突状细胞,并经肿瘤抗原冲击致敏后与肿瘤细胞融合,制备出免疫原性更强的新型瘤苗以及用淋巴细胞趋化因子基因修饰的树突状细胞均诱导出特异性抗肿瘤免疫应答13。Nikitina等认为约50%的人类恶性肿瘤存在基因突变或野生型P53,其过表达产生肿瘤表位14。用腺病毒介导野生型P53基因转染DC,并用该DC 刺激T淋巴细胞(T淋巴细胞来

13、自9例H LA2A2+的癌症患者,3例H LA2A2+的健康人,观察到该DC 对P53过表达的H LA2A2+的瘤细胞有强的细胞毒作用,而对P53非表达的瘤细胞及H LA2A2阴性瘤细胞却无细胞毒作用,该作用具有特异性并由C D8+CT Ls介导,说明野生型P53转染DC可诱导特异性的抗肿瘤免疫。Ishida等也研究了用腺病毒介导野生型P53基因转染DC,发现DC感染腺病毒48小时后转染率可达50%,转染后的DC可有效诱导活化特异性的CT L,用其免疫表达人突变型P53基因的小鼠,85%可产生完全性免疫保护15。Ranieri等用重组腺病毒载体AdEG FP(可编码一种强化的绿色荧光蛋白EG

14、FP转染DC,使其表达E B病毒抗原(如潜在膜蛋白2B,LMP2B,并与E B 病毒血清学阳性的健康供者的H LA2A2+的CT L共育,95%的DC于48小时后可检测到绿色荧光蛋白(EG FP的表达,Ad LMP2转染的DC用来激活C D8+ T细胞,观察针对LMP23292337肽的T淋巴细胞反应,第14天与第0天相比,从01003上升至013 (P<01001,第21天后可以观察到针对自体E B病毒2B淋巴细胞瘤系细胞的特异性细胞溶解反应16,提示E B病毒抗原基因转染DC可用于E B病毒相关肿瘤的免疫治疗,如鼻咽癌。另外,为其它与病毒感染有关的肿瘤的免疫治疗提供借鉴。如上所述,D

15、C疫苗在肿瘤免疫治疗中具有诸多优势,但还有许多亟待解决的问题:DC体外培养条件的规范化,如:细胞因子的种类、配伍及最佳的剂量组合等,因有些细胞因子的作用复杂,尚需明确;器皿的选择;培养基的成分须进一步明确与统一,做到有效、合理、经济的搭配。目前,各实验室所用培养基各异,如RPMI1640、I M DM等等,以使DC 活性得以最好的发挥;培养时血清的使用问题,如用何种血清,人血清、小牛血清、胎牛血清,还是不用血清,血清中抗体是否影响DC抗原位点及其活性的发挥;可被DC有效提呈的肿瘤抗原及其RNA、DNA的认识及获取,运用确实能够诱导出具有杀伤活性的CT L的抗原或基因来刺激或转导DC;成熟程度的

16、控制,由于非成熟DC的抗原摄取能力强,而成熟DC的抗原提呈能力强,前者诱发免疫耐受,后者诱发免疫应答,DC的成熟发程度被看作是DC疫苗发挥功效的平台4;制备DC基因疫苗所用的载体问题,即:转运的高效性、对DC活性的影响、对机体无或尽可能少的毒副作用等,目前,DC疫苗所用的载体有:脂质体、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等。相信,经过不断的探索与实践,DC疫苗会在肿瘤免疫治疗领域发挥出应有的作用。4参考文献1Berz ofsky J A,Jeffrey D.S trategies for designing and optimizing new gen2 eration vaccinesJ.Natu

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