植物体细胞杂交

1、植物体细胞杂交技术及其在猕猴桃育种中的应用中南林业科技大学生科院生物工程2班刘朝水20080349摘要: 植物体细胞杂交使远缘杂交不亲和的植物有可能实现遗传物质重组, 创造和培养植物新品种. 猕猴桃现有栽培品种存在一定的缺陷, 利用体细胞杂交技术对猕猴桃品质特性进行改良具有广阔的应用前景. 文章对植物体细胞杂交技术基本概况、猕猴桃原生质体游离与培养情况以及体细胞杂交技术在猕猴桃育种工作中取得的进展进行了综述, 并对植物体细胞杂交技术在改良猕猴桃种质方面的发展前景进行了展望关键词: 体细胞杂交 猕猴桃 育种体细胞杂交是细胞生物学与植物分子遗传学相结合发展起来的一项育种新技术。它是指将两种不同植物

2、的体细胞用酶分解法除去细胞壁，分离成裸露的原生质体。再使两种原生质体融合成杂种细胞，然后利用细胞的全能性在培养基上重新增生细胞壁，并进行细胞的分裂、分化与生长发育，再经诱导形成杂种株，从中选优去劣按育种目标要求培育出新品种，并创造出新物种。1植物体细胞杂交概述植物体细胞杂交过程包括植物原生质体的游离、原生质体融合、杂种细胞的筛选和植物的再生及鉴定.2原生质体融合原生质体间融合是指双亲的原生质体可以是种间、属间、甚至科间在特定的物理或化学因素作用下诱导融合成杂种细胞核质杂种或胞质杂种, 通过细胞分裂形成愈伤组织, 并分化和再生出植株 6 . 原生质体间可以发生自发融合, 但频率很低, 目前诱导原

3、生质体融合的方法主要有聚乙二醇（ PEG） 法和电融合法两种. PEG法是20世纪70年代Kao等 7 建立起来的, 该方法融合频率高, 无种属特异性, 不需要特殊的仪器, 操作简单, 是目前使用最广泛的方法. Senda等 8 首次利用电脉冲诱导原生质体融合成功后, 电融合法已成为目前最热门的物理诱导融合方式. 较之化学方法, 电融合法操作更为简单, 对细胞毒害小, 但由于需要昂贵的仪器, 目前仍不如化学法普遍.3杂种细胞的筛选由于原生质体融合的低效率和非特异性, 融合后的群体中含有未融合体、自体融合及异体融合, 因此需要在培养的时候进行筛选. 遗传互补是一种很好的筛选方法, 即两个突变的细

4、胞融合后才能正常生长 , 但由于受到突变体不易获得的限制, 该法应用并不广泛. 近来在此基础上发展了一种新的方法。通过适当的物理辐射( r射线、x射线、紫外线) 能使其核染色质受到伤害, 从而也失去持续分裂的能力.而一些化学试剂如碘乙酰胺处理能失活胞质中的酶, 从而抑制其生长. 这两类原生质体融合后的杂种细胞由于生理互补便能生长并再生为植株 . 当不能应用这类遗传标记时, 还可将原生质体用不同的活性荧光染料标记, 用流式细胞仪来分离杂种细胞 , 这种方法准确、效率高, 但价格昂贵.4植株的再生及鉴定融合后的原生质体, 在适当的培养条件下, 可以再生出新的细胞壁, 进而进行细胞分裂及分化, 形成

5、再生植株. 获得再生植株后, 还必须对其进行严格的鉴定, 可以从基因组DNA和基因表达两方面来进一步确认. 前者主要是利用各种已知的分子标记如限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA、简单重复序列、扩增片段长度多态性 进行杂种鉴定, 后者主要是通过同功酶、次生代谢产物的分析来确定杂种植株. 例如Austin等 12 通过对再生植株苹果酸脱氢酶、磷酸葡糖异构酶等酶的同工酶进行分析获得了杂种植株. 此外, 形态学及细胞学的观察和比较也是常用手段.4 体细胞杂交在猕猴桃育种中的应用猕猴桃育种研究现状 实生选种及芽变选种国内外大多数猕猴桃栽培品种均来源于实生选种, 我国从野生资源中选优,实际上也就是

6、在野生实生群体中进行单株选择. 国外的主栽品种是新西兰的“海沃德”, 是奥克兰市的HaywardWright从40棵实生苗中选育出来的, 另外, 新西兰还从世界各地大量引进的美味、中华猕猴桃实生苗中进行选种. 我国猕猴桃育种工作者在实生选育工作中也做出了辉煌的成绩. 到目前为止, 从自然野生群体及实生群体中选育出了1 000多份优良品系, 近100份通过品种审定, 部分品种已被广泛应用于生产, 如“秦美”、“米粮1号”、“徐香”、“金冠”、“魁蜜”、“金魁”等. 近年来, 通过实生选种选育了一批具有优良性状的猕猴桃新品种, 如“红阳”、“金桃”、“豫猕猴桃2号”、“江山”等尽管目前的诸多栽培品

7、种, 尤其是国外的著名主栽品种“海沃德”的优点很多, 但仍有需要改进之处, 因而对“海沃德”品种进行芽变选种成为国外猕猴桃育种的另一主要目标. 例如, 新西兰已从“海沃德”品种中选出多个芽变株系, 包括果心小、果实长芽变品系; 早熟芽变品系; 少毛芽变品系等, 此外, 新西兰猕猴桃育种家还对“海沃德”品种休眠枝条进行了辐射处理以提高芽变频率. 此外, 意大利育种学家还发现了“海沃德”雌雄同株芽变株系“HE21”与HE22”, 这是猕猴桃芽变选种的重大成果之 体细胞杂交技术在猕猴桃育种的应用目前, 猕猴桃的栽培品种往往存在某些性状缺陷, 如耐贮藏性和抗逆性较差等. 在过去几十年中, 对野生资源的

8、开发利用、实生选种、芽变选种以及常规杂交育种都取得了许多成果. 但这些育种方式存在这样或那样的问题, 如芽变育种在其他果树上应用较多, 但在猕猴桃上应用比较困难, 即使“海沃德”某些希望得到改进的性状有变异, 但在树上也难以发现, 而有些性状难以在单独的枝蔓上进行鉴评, 如丰产性、生长性能等. 猕猴桃属植物雌雄异株, 倍性复杂, 雌雄株间花期不遇使种间杂交较困难, 而且育种周期长, 具有不确定. 猕猴桃常规育种困难, 新兴的遗传转化和基因工程技术虽然能直接引入优良性状, 缩短育种时间, 但转基因的安全问题一直是全球关注的焦点, 人们对转基因食品的疑虑对该技术的应用造成了极大的限制. 随着植物体

9、细胞杂交技术在其他物种的巨大成功及猕猴桃原生质体制备与再生技术的成熟, 体细胞杂交为猕猴桃种质改良开辟了新的途径, 为解决猕猴桃育种所面临的困难提供了新的机遇.体细胞杂交技术不仅可以进行不同种、属、科间的远源杂交, 还可省去有性杂交育种中很多中间环节, 大大缩短育种周期, 并且同源原生质体融合还可实现染色体加倍, 用单倍体融合可获得纯合二倍体植株, 用单倍体和二倍体融合可获得三倍体植株, 用二倍体融合可获得同源四倍体, 用其他不同倍性原生质体融合可以产生更多染色体组组合. Guo等 34 通过柑橘种内体细胞杂交获得150多个杂种细胞系, 初步筛选发现78%为四倍体, 其余的为二倍体, 通过流式

10、细胞仪、SSR、(mt) RFLP、( cp) SSR等进一步分析,在8个株系中, 6个为四倍体, 其中4个为异源四倍体, 1个为同源四倍体, 1个为细胞质杂种四倍体, 2二倍体株系均是胞质杂种. Grosser等 35 通过体细胞杂交获得抗刺线虫的砧木, 而且由于这些体细胞杂种的砧木的染色体多倍性, 还可控制柑橘树的大小, 从而提高产量. Pavan等 36 通过体细胞杂交获得抗柑桔溃疡病菌和苟养木杆菌的杂种植株. Filho等 37 通过测试一系列的体细胞杂交植株茎杆和根对黑胫病和柑橘衰退病的抗性, 以期获得抗黑胫病和柑橘衰退病的体细胞杂种作为砧木, 并筛选到一些抗性株系.Viloria等

11、 38 通过体细胞杂交获得了无籽三倍体品种. 体细胞杂交技术在柑橘育种中的巨大成功可为其在猕猴桃中的应用提供借鉴.然通过体细胞杂交技术改良猕猴桃种质方面的报道还不多, 但已展示出了其广阔的应用前景. 从遗传改良上看, 应有目的有意识的选择亲本进行原生质体融合, 不断改良猕猴桃的品质, 如将经济价值高的美味猕猴桃与抗寒性极强的软枣猕猴桃进行体细胞杂交得到Vc含量高、风味佳、品质优, 且能在低温地区栽种的新品种 41 . 又如, 中华猕猴桃早熟、果大、形美、味佳, 但果实不耐贮藏、货架期短、离园价低, 也可通过体细胞杂交技术淘汰那些极不耐贮藏的品种. 通过不同果肉颜色的优良品种进行体细胞杂交还可筛

12、选各种果肉颜色的良种, 并可获得不同染色体倍数的品系, 染色体多少往往与果实的大小相关联. 同时, 通过体细胞杂交也可以筛选一些其他特异性状的品种, 如雌雄同株类型、少籽类型、多汁适合加工类型以及食用、药用、观赏用一体化类型等. 通过栽培品种和野生近缘种间的体细胞杂交可以有效地将野生种的优良性状转至栽培品种以扩大栽培品种的基因库.5 展望随着农业科技进步、农业生产的不断发展与人类社会对优质农产品日益增长的需要，必然要求育成更多高产、优质、多抗与用途多样的农作物新品种用于农业生产。要实现上述育种目标，就必须采用更为科学、先进与创新的农作物育种新技术。 通过以上体细胞杂交技术在国内外农作物育种上开

13、发应用进展情况的介绍，可以充分肯定，该项技术不仅可以打破种间杂交障碍，还可以扩大物种杂交范围，提高物种变异频率，缩短育种周期，拓宽育种领域，提高育种水平。尤其是国内外不同性能的体细胞融合仪的研制成功，为该项技术的开发应用提供了更为先进的仪器设备，创造了更为有利的条件。因此可以预测并展望，在未来加速农作物育种与农业生产发展的进程中，体细胞杂交育种技术必将具有更为广泛的开发应用前景。6 参考文献:1 肖尊安, 沈德绪, 林伯年. 美味猕猴桃子叶愈伤组织的原生质体培养和再生植株 J . 武汉植物学研究, 1993, 11 (3) :247 - 251.2 张远记, 母蝎金, 蔡起贵, 等. 毛花猕猴

14、桃原生质体再生植株 J . 植物学报, 1995, 37 (1) : 48 - 52.3 肖尊安, 沈德培, 林伯年. 猕猴桃愈仿组织的生理差异与原生质体生长和分化的关系 J . 植物生理学报, 1992, 184 GROSSER JW, CHANDLER J L, DUNCAN LW. Production ofmandarin -pummelo somatic hybrid citrus rootstockswith potential for imp roved tolerance / resistance to sting nematode J . Scientia horticult

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