松果腺对辐射免疫兴奋效应调节作用的研究

1、    松果腺对辐射免疫兴奋效应调节作用的研究        摘要目的和方法：观察75 mGY X射线全身照射去松果腺昆明系雄性小鼠，血清皮质酮，脾和胸腺细胞免疫功能变化及体内、外给予褪黑素对其免疫功能的影响。结果：去松果腺小鼠经75 mGy X射线全身照射后，血清皮质酮水平显著升高，脾细胞对ConA反应性和胸腺细胞自发增殖能力明显降低，体内注入褪黑素或体外培养细胞加入褪黑素可使因去松果腺免疫功能降低而重新升高。结论：松果腺褪黑素对低剂量辐射引起的免疫兴奋效应有调节作用。主题

2、词松果体；褪黑激素；辐射；皮质酮；免疫，细胞 Studies of regulative function of pineal gland on radiation hormesis in theimmune system after low dose radiationLIANG Yan,ZHANG Ming,LIU Shu-ZhengInstitute of Neuroendocrinology Research,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun(130021)Abstract AIM and METHOD:To

3、 observe the changes of plasma corticosterone levels,thymocyte and splenocyte cell on immune functions,the effects of pinealectomized mice injected with melatonin on immune functions and the effects of melatonin on immune functions in vitro on pinealectomized mice after whole body irradiation with 7

4、5 mGy X-rays.RESULTS：After pinealectomized mice was irradiated WBI with 75 mGy X-rays,we found levels of plasma corticosterone increased obviously,and the effects of the proliferative reaction of splenocytes to ConA and spontaneous proliferation of thymocytes was found to be decrease. But injecting

5、melatonin into pinealectomized mice or putting melatonin in the cultured cell,its immune functions might renew the enhancement.CONCLUSION：Melatonin of pineal gland might regulate the immunoenhancement induced by low dose radiation.MeSHPineal body; Melatonin; Radiation; Corticosterone; Immunity,cellu

6、lar近年来，大量文献资料证明松果腺是一个重要的神经内分泌转换器，可将神经信号转换成激素的分泌，是积极参与机体调节的机能器官1。松果腺分泌的主要激素是褪黑素(melatonin,MLT),MLT有广泛的整合、更新等生物学作用，其中使下丘脑-垂体-肾上腺和性腺系统功能下调，增强免疫功能尤为突出，还有调节生物节律、抗衰老、抗肿瘤等作用，可能是神经内分泌免疫调节的重要活性物质2，3。低剂量辐射(low dose radiation,LDR)全身照射(whole body irradiation,WBI)可引起免疫系统的兴奋效应，主要表现在以T淋巴细胞功能激活为主的细胞免疫和体液免疫功能的增强并可提高

7、机体的抗瘤作用4，5，在LDR诱发免疫功能增强的同时伴有下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统功能下调等神经内分泌功能的改变，神经内分泌对免疫系统的调节可能是LDR免疫兴奋效应发生的必要条件，松果腺MLT与辐射免疫兴奋效应的关系值得研究。材料与方法一、实验动物与处理：实验用昆明系雄性小鼠由本校实验动物部提供，体重(20±2) g。应用Philips深部X线治疗机给小鼠WBI，电压200 kV，电流10 mA，滤片铜0.5 mm，铝1.0 mm，球靶距离212 cm，剂量率12.5 mGy/min,总剂量75 mGy。动物处理：1.假照射组和去松果腺假照射组：将正常小鼠和去松果腺小鼠经假照射处理

8、后做为实验的对照组。2.去松果腺照射组：采用激光去松果腺切除术，切除小鼠松果腺(pinealectomy,PY)，饲养3 d，用75 mGy X射线WBI。3.去松果腺体内注射MLT再照射组：激光切除松果腺后，每天每只小鼠肌注MLT 1 mg/次，连续注射3 d，共3 mg，然后用75 mGy X射线WBI。二、血清皮质酮的测定：采用本室常规方法，竞争性蛋白质结合分析法6。三、脾脏和胸腺细胞悬液制备：断头处死小鼠，无菌条件下取脾脏和胸腺，分别置于RPMI 1640培养液中，用玻片研磨法制备单细胞悬液，1 500 r/min，离心5 min，弃上清，用Hanks液洗涤细胞2次，重悬于含有10%新

9、生小牛血清的RPMI 1640培养液中，经200目尼龙网过滤后计数，根据检测指标，调到所需细胞浓度。四、脾细胞对ConA反应性测定：在96孔培养板上，每孔加5×106个mL脾细胞悬液100L和6 mg/mL ConA 100 L，每份样品设自身对照，平行样3孔，37培养72 h,终止培养前6 h，每孔加入3H-TdR 18.5 kBq/25 L，多头细胞收集器收获细胞，应用1214型Reckbeta液闪仪测其counts.min-1。五、胸腺细胞自发增殖反应测定：在96孔培养板上，每孔加5×106个/mL胸腺细胞悬液200L及3H-TdR 18.5 kBq/25L,平行样3

10、孔，培养4 h后收获细胞，测其counts.min-1。六、体外培养的脾细胞加入MLT时对ConA反应测定：在96孔培养板上，每孔加入5×106个/mL脾细胞悬液100 L,20 g/mL ConA 50L,0.4 mol/L MLT 50L。37，培养72 h，终止前6 h,每孔加3H-TdR 18.5 kBq/25L,收获细胞，测其counts.min-1。七、体外培养的胸腺细胞加MLT后自发增殖能力的测定：在96孔培养板上，每孔加入1×107个/mL胸腺细胞悬液100 L,0.2 mol/L MLT 100 L,平行样3孔，每孔加入3H-TdR 18.5 kBq/25

11、L。在37，培养4 h，收集细胞，测其counts.min-1。结果一、低剂量辐射对去松果腺小鼠血清皮质酮水平的影响：采用激光术切除小鼠松果腺3 d后，给予75 mGy X射线WBI，观察停照后不同时间血清皮质酮水平的变化。结果表明，去松果腺小鼠受照后，血清皮质酮水平明显高于正常假照组和去松果腺假照组。其中停照后30 min、1 h、2 h、24 h和72 h组差异非常显著(P0.01)。去松果腺假照组血清皮质酮含量虽然比正常假照组高，但差异不显著，见表1。表1去松果腺小鼠75 mGy X射线全身照射后血清皮质酮水平的时程变化Tab 1Changes of serum corticostero

12、ne levels of pinealectomized miceat different time after WBI with 75 mGy X-rays(±s,n=6)Time intervalsCS (g/100 mL)Sham-irradiation4.71±1.85PY-sham-irradiation6.53±3.1315 min8.69±0.3830 min9.96±0.20*1 h14.95±0.77*2 h13.01±2.63*4 h11.36±7.448 h11.20±4.65*12

13、 h6.56±3.6424 h15.06±4.19*72 h16.18±1.27*P0.05,*P0.01,vs sham-irradiation group 二、低剂量辐射对去松果腺小鼠免疫功能的影响：去松果腺小鼠，给予75 mGy X射线WBI，观察停照后24 h和72 h免疫学参数的变化。(一)脾细胞对ConA反应的变化：去松果腺小鼠，照射后不同时间，脾细胞对ConA的反应能力明显降低，见表2。从表中可看出，去松果腺假照组和去松果腺照射后24 h和72 h组脾细胞在ConA刺激下，3H-TdR掺入量显著少于正常假照组(P0.05,P0.01)，去松果腺照射后

14、24 h及72 h组与去松果腺假照射组对比，差异不显著。表2去松果腺小鼠75 mGy X射线全身照射后脾细胞对ConA反应性变化Tab 2Changes of proliferative reaction of splenocytes to ConA inpinealectomized mice after WBI with 75 mGy X-rays (±s,n=5)Groupcounts.min-11×106 cellsSham-irradiation23 029±4 620PY-sham-irradiation16 551±3 884*24 h12

15、 625±2 160*72 h13 004±3 969*P0.05,*P0.01,vs sham-irradiation group (二)胸腺自发增殖能力的变化：去松果腺小鼠，经75 mGy X射线WBI后，胸腺细胞3H-TdR自发掺入率如表3所示。停照后24 h、72 h和去松果腺假照射组胸腺细胞3H-TdR掺入率均低于正常假照射组，其中24 h组差异非常显著(P0.01)，72 h组差异显著(P0.05)，去松果腺假照组差异不显著。表3去松果腺小鼠75 mGy X射线照射后胸腺细胞自发掺入率变化Tab 3Changes in spontaneous incorpora

16、tion of thymocytes in pinealectomizedmice after WBI with 75 mGy X-rays （±s,n=5)Groupcounts.min-11×106 cellsSham-irradiation18 468±1 507PY-sham-irradiation15 862±6 74424 h4 446±1 180*72 h12 898±5 214*P0.05,*P0.01,vs Sham-irradiation group (三)体内注射MLT对去松果腺小鼠辐射免疫效应的影响：去松果腺小

17、鼠，每日肌肉注射1 mg/次MLT，连续注射3 d,共3 mg，然后给予75 mGy X射线WBI，停照后24 h和72 h组脾细胞对ConA反应能力均高于去松果腺假照组，其中72 h脾细胞在ConA刺激下3H-TdR掺入率差异显著(P0.05)；而胸腺细胞自发掺入率明显高于去松果腺假照组，差异非常显著（P0.01)，与正常假照组相比差异不显著，结果见表4。表4体内注射MLT对去松果腺小鼠辐射免疫效应的影响Tab 4Effects of pinealectomized mice injected with MLT after WBI with 75 mGy X-rays on immune f

18、unctions (counts.min-11×106 cells,±s,n=5)GroupProliferative responseof splenocytesSpontaneousincorporationof thymocytessham-irradiation26157±986021288±3532PY-sham-irradiation20896±434315675±1071*24 h28280±658824556±547672 h27589±507222760±2146*P0.05,

19、vs sham-irradiation group; P0.01,vs PY-sham irradiation group (四)MLT对体外培养的去松果腺照射小鼠免疫细胞功能的影响：去松果腺小鼠在接受75 mGy X射线全身照射后24 h和72 h进行脾细胞、胸腺细胞体外培养时，加入MLT观察脾细胞和胸腺细胞的功能变化，结果见表5，照射后24 h和72 h小鼠脾细胞3H-TdR掺入率明显高于正常假照射组和去松果腺照射组(P0.05，P0.01)，而胸腺细胞自发增殖率明显高于正常假照射组（P0.05)，更加显著高于去松果腺假照射组(P0.05)。表5MLT对体外培养的去松果腺照射小鼠免疫细胞功

20、能的影响Tab 5Effects of MLT on immune functions in vitro culturedimmune cell on pinealectomized mice after WBI with 75 mGy X-rays (counts.min-1/1×106 cells,±s,n=5）GroupProliferative responseof splenocytesSpontaneousincorporationof thymocytesSham-irradiation26 157±9 86021 288±3 532PY-

21、sham-irradiation20 896±4 34315675±1 07124 h39175±7795*32 294±10 106*72 h37264±5234*29 017±6 627*P0.05,vs sham-irradiation group; P0.01,vs PY-sham irradiation group 讨论本研究主要观察了去松果腺小鼠，给予75 mGy X射线全身照射后，血清皮质酮水平的变化及免疫细胞功能的变化。结果表明低剂量辐射不仅未能引起在照射正常动物时所出现的肾上腺皮质功能下调7，反而明显增高，照射后血清皮质酮水平一直浮动在正常对照水平之上，1 h、24 h、72 h明显高于正常对照组，随时间延长而呈双峰型变化。由此推测，低剂量辐射引起的肾上腺皮质功能变化与松果腺有密切关系，去松果腺可能解除了MLT对下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制作用，其双峰型变化的机制有待进一步研究。去松果腺小鼠75 mGy X射线全身照射后免疫功能变化