晶体表面结合蛋白对草酸钙晶体生长的抑制作用

1、    晶体表面结合蛋白对草酸钙晶体生长的抑制作用        摘要为观察晶体表面结合蛋白(CSBP)对草酸钙晶体生长的影响，用层析法分离提取正常人和草酸钙结石病人CSBP，应用种晶体技术检测CSBP、尿凝血酶原激活肽F1片段(UPTF1)和白蛋白在体外对草酸钙晶体生长的作用。结果发现正常人CSBP和UPTF1能显著抑制草酸钙晶体的生长，结石病人CSBP的抑制活性低于正常人。提示病人CSBP中UPTF1减少致抑制活性降低与结石形成有关。关键词尿结石草酸钙 

2、0;   In vitro inhibition of calcium oxalate crystal growth by crystal surface binding proteinsZhu Shaoxing,Zhang Yongshang,Liu Jihong,et al.Department of Urology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030AbstractCrystal surface binding proteins(CSBP) were isolated by chromatogr

3、aphy.The effects of proteins on calcium oxalate crystal growth in vitro were tested using a seeded crystallization technique.It was observed that CSBP and urinary prothrombin F1(UPTF1) of normal subjects could apparently inhibit calcium oxalate crystal growth.CSBP of stone formers showed lower inhib

4、itory activity than that of normal.The inhibitory activity of albumin,whether in normal subjects or in stone formers,was weak.It was concluded that UPTF1 is a potent inhibitor of calcium oxalate crystal growth.A dificiency of UPTF1 in CSBP of stone formers may be related to calculogenesis.Key wordsU

5、rinary calculiCalcium oxalate     本课题为国家教委资助课题作者单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院泌尿外科(朱绍兴现在福建医科大学附属协和医院泌尿外科)新鲜草酸钙晶体表面结合物质(CSBS)主要由蛋白质和葡胺聚糖两类物质组成，有关它们在结石形成初始阶段的作用是近年来人们关注的问题之一1，2。我们观察了其中的蛋白质组分在体外对草酸钙晶体生长的抑制作用，并对正常人和结石病人蛋白质的抑制活性加以比较。报告如下。 材料与方法一、草酸钙晶体表面结合物质的制备收集8例正常男性(2435岁)和8例男性草酸钙结石病人(28

6、43岁)尿液，按文献方法制备晶体表面结合物质3。二、晶体表面结合物质中蛋白质的分离DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析法分离CSBS中的蛋白质和葡胺聚糖，羟基磷灰石吸附层析法进一步分离蛋白质的各个组成部分4。三、晶体表面结合蛋白对草酸钙晶体生长体外抑制活性的测定取pH6.5的Tris缓冲液48ml，置37恒温结晶器内，加0.03mol/L CaCl2和0.03mol/L Na2C2O4各1ml。混匀得0.6mol/L的草酸钙亚稳过饱和溶液50ml。实验分四组：A组加CSBP，使蛋白终浓度为10mg/L；B组加白蛋白，蛋白浓度10mg/L；C组加正常人尿凝血酶原激活肽F1片段(U

7、PTF1)，使蛋白终浓度分别为0.06、0.12、0.25、0.50和1.00mol/L；D组加等量双蒸水为对照。10分钟后取样3ml经0.22m微孔滤膜过滤于试管中。加一水草酸钙籽晶0.5ml(5mg/ml)，搅拌30秒后孵化3小时，各取样3ml过滤于试管中。原子吸收分光光度计测滤液中Ca的吸光度(A)，按下式计算各蛋白质组分对草酸钙晶体生长的抑制指数(I.I)。I.I=(1-(AoAt)/(AoAc)×100%上式中Ao为加籽晶前滤液中Ca+的吸光度；Ac、At分别为对照组和实验组加籽晶孵育后滤液中Ca的吸光度。结果一、蛋白质层析分离结果CSBS中主要含蛋白质和葡胺聚糖两类大分子

8、物质；正常人CSBP含UPTF1和白蛋白；病人的CSBP以白蛋白为主，UPTF1含量明显低于正常人。二、各组分对草酸钙晶体生长的抑制活性正常人和结石病人CSBP的抑制指数分别为42.3%和19.2%，有显著性差异；白蛋白的抑制活性较低，分别为15.4%和11.5%。正常人UPTF1的作用呈剂量依赖性，UPTF浓度为0.06、0.12、0.25、0.50和1.00mg/L时，其I.I值依次为11.5%、15.4%、23.1%、42.3%和53.8%。讨论基质约占草酸钙结石干重的2%6%，其中可溶成分仅25%左右。基质提取过程，老化、结石生长过程中尿液大分子物质组成的变化等均可影响基质化合物的组成

9、和分子结构。为了避免上述因素的干扰，采用草酸钙过饱和结晶法制备新鲜晶体表面结合物质，研究结石形成初始阶段基质的组成成分及其对成石的作用，发现尿液中的凝血酶原激活肽F1片段和葡胺聚糖等物质能选择性地结合到草酸钙晶体表面4，5。本实验结果与报道结果类似，不同之处在于除UPTF1外，晶体表面结合物质中还含有较多白蛋白。造成这种差异的原因可能是本实验中所采用的孵化时间较长，使白蛋白有充分的时间吸附到晶体表面。UPTF1通过-羧基谷氨酸残基与钙离子的作用快速结合到含钙晶体上，白蛋白则以较缓慢的物理方式与晶体结合。尿液大分子物质是结石基质的组分或重要前体，它可通过诱导和促进异质成核，提供晶体生长和聚集的模

10、板，覆盖晶体表面防止重新溶解等作用而促进结石形成。也可封闭晶体表面活性生长位点或改变晶体表面电荷与能量分布，抑制结晶的生长和聚集。Koide等1认为晶体表面结合物质是草酸钙结晶生长和聚集的抑制因子；Ryall等5将晶体表面结合物质进一步纯化、分离后发现，其主要组分蛋白质和葡胺聚糖均可抑制草酸钙晶体的生长和聚集，其中所含的UPTF作用最强。同位素示踪和扫描电镜观察证实UPTF通过结合到晶体表面而发挥抑制作用。白蛋白是尿液中含量最多的血清蛋白质，能抑制草酸钙晶体的成核和聚集，对晶体生长的抑制活性很低6。本实验结果显示，CSBP、UPTF1和白蛋白均能在体外抑制草酸钙结晶生长，UPTF1作用最强，其

11、抑制活性呈剂量依赖性，白蛋白抑制作用较弱。说明UPTF1的作用构成CSBP抑制活性的主体，提示UPTF1可能在影响结石形成方面占有比较重要的地位。Drach等7报道结石病人尿液抑制活性低下，其中促进结晶生长聚集作用的高、中分子量蛋白质含量高于正常人，而主要起抑制作用的低分子量蛋白质含量减少；进一步研究发现，结石病人尿中肾钙素、TH蛋白等抑制物的分子结构发生改变，对草酸钙晶体生长和聚集的抑制作用也相应降低8，9。推测尿液大分子物质组成和功能的变异与结石形成有关。本实验结果支持这种推测，结石病人CSBP的抑制活性低于正常人，白蛋白的作用与正常人相似。分析CSBP的组成后，我们认为UPTF1缺乏是导

12、致病人CSBP抑制活性低下的重要原因。应用外源性葡胺聚糖类物质防治泌尿系结石已取得一定进展10，11。可以预计，对尿液中蛋白质类大分子物质的研究除了有助于更清楚地认识尿石症的发病机制外，还能为临床上寻找有效的结石防治方法提供理论依据和指导方向。参考文献1Koide T,Yoshioka T,Yamaguchi S,et al.Urinary crystal surface binding substances on calcium oxalate crystals.Urol Res,1990,18387-392.2Doyle IR,Marshall VR,Dauson CJ,et al.Cal

13、cium oxalate crystal matrix extract:the most potent macromolecular inhibition of crystal growth and aggregation yet tested in undiluted human urine in vitro.Urol Res,1995,2353-62.3Morse RM,Resnick MI.A new approach to the study of urinary macromolecules as a participant in calcium oxaltae crystalliz

14、ation. J Urol,1988,139869-873.4刘继红，章咏裳，吉冈俊照，等.尿草酸钙晶体表面结合物质蛋白质的分离和初步鉴定.中华泌尿外科杂志，1995，16579-582.5Ryall RL,Grover PK,Stapleton AMF,et al.The urinary F1 activation peptide of human prothrombin is a potent inhibitor of calcium oxalate crystallization in undiluted human urine in vitro.Clin Sci,1995,89505-

15、541.6Worcester EM,Nakagawa Y,Wabner CL,et al.Crystal absorption and growth slowing by nephrocalcin,albium,and tamm-horsfall protein.Bio Chem,1988,225F1197-F1205.7Drach GW,Kraljevich Z,Randolph AD.Effects of high molecular weight urinary macromolecules on crystallization of calcium oxalate dihydrate.J Urol,1982,127805-810.8辛殿旗，冯陶，窦长琪，等.正常人和结石病人尿中不同分子量的分离物对草酸钙晶体的影响.中华实验外科杂志，1994，11343-344.9Coe FL,Nakagawa Y,Parks JH.Inhibitors within the nephron.Am J Kidney Disease,1991,17407-413.10张石