微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告

1、微量凯氏定氮法测定蛋白质含量试验报告一、试验目的1.学习微量凯氏定氮法的原理2.把握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等）二、试验原理凯氏定氮法常用于测定自然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。当自然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称为“消化”。此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高溶液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化过程：蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气。反应方程

2、式如下：吸取与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸取，待吸取完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色)，最终依据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。三、试验试剂、材料和器材试验材料：食用面粉。试验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、克氏催化剂、2%硼酸、指示剂、0.01M HCL。试验器材：凯氏烧瓶、电炉、凯氏定氮蒸馏装置、锥形瓶、100ml容量瓶、酸式滴定管。四、操作步骤1.消化（1）精确称取1克食用面粉，用称量纸卷好当心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上；（2）向另一烧瓶加入1ml水作空白对比；在每个烧

3、瓶内加入硫酸钾硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀；（3）将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化；（4）在消化开头时，应把握火力，不要使液体冲到瓶颈；（5）待瓶内水汽蒸完，硫酸开头分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，连续消化，直至消化液呈透亮绿色为止；（6）消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（留意慢加，边加边摇）；（7）冷却后将瓶中内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最终定容至刻度摇匀，做上记号备用。2.蒸馏（1）蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部2/3处即

4、可。（2）取3个50ml的锥形瓶，分别加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。（3）加样 用移液管吸取2ml消化液，当心地由漏斗D倾入B室； 取一个盛有硼酸的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。（4）蒸馏 用酒精灯加热，维持火力恒定，沸腾不行高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，连续蒸馏5分钟； 然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最终用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶预备滴定。（5）空白蒸馏 用移液管分别吸取2ml蒸馏水按上述操作步骤进行

5、蒸馏。LH仪器的洗涤：3.滴定（1）蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。（2）记录所用盐酸的量。4.计算若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数； C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按试验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。五、试验结果序号称量样品(g）滴定样品用去的盐酸（ml）滴定空白用去的盐酸（ml）1115.2 0.122115.4若测定

6、的样品含氮量部分只是蛋白质，则：式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数； C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按试验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。六、留意事项1.本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应削减取样量或将样液稀释。2.勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。3.蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，连续蒸馏1min

7、，将附着在尖端的吸取液完全洗入吸取瓶内，再将吸取瓶移开，最终移开酒精灯，绝不能先灭灯，否则吸取液将发生倒吸。4.硼酸吸取液的温度不应超过40°C，否则氨吸取减弱，造成损失，可置于冷水浴中。混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。七、思考题1.写出一下各步的化学反应方程式:蛋白质的消化、氨的蒸馏、氨的滴定。答：蛋白质的消化: 氨的蒸馏： 氨的滴定： 2.指出本测定方法产生误差的缘由答：在消化过程中，消化时间，催化剂，浓硫酸都要一样，肯定要消化完全。在消化过程中蛋白质附着在凯氏烧瓶壁上没有被消化也会影响最终的浓度。蒸馏过程中，蒸馏出来的液体量肯定要相同，由

8、于不一样的蒸馏水，最终结果不一样，在蒸馏的过程中一开头要加入买的蒸馏水，蒸馏过程中加入的是自己用自来水蒸馏的。蒸馏中出气孔的管子肯定要插入硼酸液面以下，蒸馏过程中保证冷凝水始终在流淌。蒸馏过程中定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管确定不能漏气。加入消化液后加氢氧化钠应当心缓慢加入，开关甲不能常开，加完后加水液封。滴定过程中应一滴一滴加入，滴定速度过快简洁滴定过量。滴定过程中仰视刻度结果偏小，俯视刻度线结果偏大。蒸馏装置的洗涤过程中洗涤不洁净也会导致误差的消灭。本试验方法适合测量0.05-3.0mg氮，含量过大应当削减取样量或者样液稀释。否则会产生误差。3.消化过程中产生何种有毒气体？如何推断

9、消化终点？答：可能会产生一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫。消化终点判定：在消化开头时，应把握火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开头分解并放出白烟后，适当加强火力，连续消化，直至消化液呈透亮绿色为止。八、争辩经过本次利用微量凯氏定氮法进行面粉中蛋白质的粗测定试验，使我较为娴熟的把握了凯氏定氮蒸馏装置的使用，并且了解了其工作原理，这对于以后的学习是有很大挂念的。经查阅资料得，面粉中蛋白质的含量或许在9左右，本次试验的结果为2.66，总体来讲，本次试验较为失败，没能够粗略地测量出了面粉中蛋白质的含量。经过分析后，得出几点影响试验结果的因素，如下：1.在消化过程中，消化时间，催化剂，浓硫酸都要

10、一样，肯定要消化完全。在消化过程中蛋白质附着在凯氏烧瓶壁上没有被消化也会影响最终的浓度；2.蒸馏过程中，蒸馏出来的液体量肯定要相同，由于不一样的蒸馏水，最终结果不一样，在蒸馏的过程中一开头要加入买的蒸馏水，蒸馏过程中加入的是自己用自来水蒸馏的。蒸馏中出气孔的管子肯定要插入硼酸液面以下，蒸馏过程中保证冷凝水始终在流淌。蒸馏过程中定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管确定不能漏气。加入消化液后加氢氧化钠应当心缓慢加入，开关甲不能常开，加完后加水液封；3.滴定过程中应一滴一滴加入，滴定速度过快简洁滴定过量。滴定过程中仰视刻度结果偏小，俯视刻度线结果偏大；4.蒸馏装置的洗涤过程中洗涤不洁净也会导致误差的消灭；5.本试验方法适合测量0.05-3.0mg氮，含量过大应当削减取样量或者样液稀释。否则会产生误差；6.用量筒量取溶液时，仰视或俯视读数，会导