扁平疣患者人乳头瘤病毒基因型的检测分析

1、扁平疣患者人乳头瘤病毒基因型的检测分析    摘要目的：探讨四川地区扁平疣皮损组织中人乳头瘤病毒（HPV）基因型的感染情况。方法：采用核酸分子快速导流杂交基因芯片技术，对92例扁平疣患者皮损组织进行HPV感染分型的检测。结果：92份扁平疣皮损标本中HPV阳性88例，检出率是 95.65%；检测出5种HPV亚型，各型别检出率由高到低依次是HPV11，HPV18，HPV6，HPV59，HPV58。其中单一感染阳性率达到 60.86%，多重感染达到 34.78%。二重感染检出率由高到低为： HPV11和HPV18 ，HPV11和HPV6， HPV11和HPV5

2、9。有2例为三种感染，均为 HPV6、HPV11和HPV59。结论：四川地区扁平疣患者以低危型HPV11感染为主，高危型HPV感染多以混合感染的形式存在。 关键词扁平疣；人乳头瘤病毒；基因型 中图分类号R739.5 文献标识码A 文章编号1008-6455（2013）01-0069-02 Detection and analysis of Human Papillomavirus Genotype in Patients with Flat Warts LIN Xin-yu1， CHEN Jing-yu2，WANG Fang1， LIAO Heng-li1，LIN Min3 （1.Depart

3、ment of Dermatology，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China；2.Department of Dermatology，The Sixth People's Hospital of Chengdu；3.Department of Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial

4、People's Hospital） Abstract： Objectives To study the infection and the distribution of the Human papillomavirus（HPV） DNA in Flat Warts specimens in Sichuan territory. Methods Ninety-two samples from patients with Flat Warts were examined for the identification of HPV genotypes with flow-through

5、hybrization and gene chip. Results Of the ninety-two patients studied，eighty-eight cases were positive，the total positive rate was 95.65%.Five genotypes were found by HybriMax in total twenty-one HPV genotypes in ninety-two clinic samples； the most positive percentage of various subtypes of HPV was

6、HPV11，followed by HPV18， HPV6， HPV59 and HPV58. The positive rate of single subtype infection of HPV was 60.86%，the positive rate of multiple subtypes infection of HPV was 34.78%. The most positive percentage of two subtypes infection of HPV was HPV11and HPV18，followed by HPV11 and HPV6， HPV11 and H

7、PV59. And three different HPV subtypes infection（HPV6、HPV11and HPV59）were detected in two samples. Conclusions Our results indicate that HPV11 is the most prevalent HPV subtype of Flat Warts in Sichuan territory， high-risk HPV genoytpes exist mainly in multiple subtypes infection. Key words： Flat Wa

8、rts ； human papillomavirus；genotype 扁平疣好发于青少年颜面和手背等处，是一种由人乳头瘤病毒（human papillomavirus， HPV） 感染表皮所致的良性增生物，病程慢性。部分患者病情顽固，尤其是在免疫力缺陷的患者，疣体很少自然消退1。HPV 是一种小分子双链 DNA 病毒， 对人皮肤、粘膜有高度亲嗜性，根据其基因序列的多态性目前已发现 HPV 有 100 余种临床亚型2。目前关于扁平疣治疗方面的文章较多，但关于扁平疣患者HPV感染基因型的报道很少。导流杂交基因芯片技术是近年来检测 HPV 亚型的一门新技术， 可同时一次性检测到 21 种 HPV

9、DNA 的基因型，本文拟通过该基因芯片分型技术来检测92例四川地区扁平疣患者皮损中的 HPV DNA，以探讨该地区扁平疣HPV基因型的感染状况和HPV 基因型的分布特点。 1 材料和方法 1.1病例选择：92例份标本均来自本院2010年10月2012年10月门诊扁平疣患者， 标本采集前均由医师征得患者的知情同意。男40例，女52例；年龄1047岁，平均33.7岁； 皮疹分布于颜面及手背，病程2个月4年，平均6.8个月；均未发现伴有影响免疫系统的疾病。 1.2 标本采集：常规消毒，采集疣体组织置于专用灭菌管中，冻存于-20待检。 1.3 仪器与试剂：杂交仪（凯普医用核酸分子快速杂交仪），PE 9

10、600 PCR仪，隔水式恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），台式高速离心机 （Thermal），超净工作台（Heal Force）。人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒（凯普）：包括DNA提取试剂盒；HPV基因分型检测试剂盒-PCR试剂盒；HPV基因分型检测试剂盒-杂交试剂盒。 1.4 HPV基因分型检测：采用 HybriMax 技术检测 21 种 HPV 亚型（包括 HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、56、58、59、68、53、66 和 CP8304）。 实验步骤：样本HPV DNA提取， PCR扩增，核酸分子快速导流杂交，结

11、果判读，按芯片上HPV亚型分布的相应着色位点判断。检测结果阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点。根据膜条HPV分型分布图，判断阳性点为何种HPV病毒类型。多个圆点阳性即为多重感染，每张芯片设有 PCR 反应质控点和杂交显色质控点各一个。 1.5 统计学分析：采用 SPSS11.0 进行统计学处理。 2 结果 2.1 HPV DNA的基因型检测结果：本研究所有病例标本92例中，有 88例检测出 HPV DNA 的基因型，检出率是 95.65%；其中高危型感染阳性率达到 52.18%，低危型感染阳性率达到 80.43%。所有能检测的 21 种HPV基因型中，检测出5种HPV基因型，检出率从高到低依次为：H

12、PV11，HPV18， HPV6，HPV59和 HPV58，未发现HPV16、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53 、56、66、68及CP8304 型的感染。92例扁平疣患者HPV基因型检测的结果见表1。 2.2 HPV单一及多重感染情况分析：92 例扁平疣患者中检测出 HPV基因型阳性者 88 例，88例 HPV DNA 阳性样本中，HPV单一型感染56例，单一感染率是 60.85%，有32例存在23种亚型的感染，二重感染出率是32.60%，三重感染检出率为2.17%，多重感染率达到34.77%。高危型/低危型存在混合或交叉感染，其中以HPV11和HPV18 的

13、二重感染最多见，其次为HPV11和HPV6， HPV11和HPV59。有2例为三种感染，均为 HPV6、HPV11和HPV59。高危型 HPV59均以混合感染形式存在，未发现单一 感 染 。高危型 HPV58均以单一感染形式存在，未发现混合感染。92例扁平疣患者HPV单一及多重感染情况见表2。 3 讨论 人乳头瘤病毒能引起人类皮肤和黏膜的增生性病变，HPV 按基因组的不同可分为若干型， 当分离株病毒的 L1 基因与已知序列近源病毒株同源性<90%时，则可定为新的型别3。不同型别的HPV的致病能力有很大差异，依据HPV引起的增生性病变是否致癌，可将其分为低危型和高危型两大类。韩国学者检测了

14、30例扁平疣患者的皮损标本，有29例为HPV3感染，1例为HPV94感染所致4，国内余元勋也报道扁平疣主要由高危型的HPV3型引起5。也有国外学者报道扁平疣主要由HPV1型引起6。扁平疣合并其他疾病的患者有不同类型病毒的感染，有学者在肾移植患者的扁平疣标本中检测出HPV49感染7，在急性淋巴细胞白血病患者的扁平疣标本中检测出HPV126感染8。HPV基因芯片分型是目前最先进的检测技术，它将基因扩增技术、导流杂交技术及基因芯片技术结合起来，利用了PCR技术高灵敏性、导流杂交技术的高特异性和基因芯片的高通量性特点，本研究应用基因芯片分型技术检测扁平疣皮损中的HPV DNA，可同时一次性检测到21种

15、HPV的基因型，包括HPV6、11、42、43、44等5种低危型； HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种高危型以及HPV53、66和CP8304等3种中国人特有的中危型。通过对92例扁平疣皮损标本的HPV基因分型检测，本研究有如下发现：1.扁平疣皮损中HPV基因型以低危型为主，本研究中，HPV基因型的检出率是95.66%，所有检测的 21 种基因型中，扁平疣皮损涉及的HPV亚型的种类较少，仅检出5种。尖锐湿疣皮损HPV亚型的种类较多，有学者检出18种9，有学者检出10种10。本研究HPV检出率从高到低依次为：HPV11，HPV18， HPV

16、6，HPV59，HPV58，其中高危型感染阳性率达到 52.18%，低危型 80.43%。高危型别涉及HPV18、58和59型。低危型别涉及HPV6和11型。说明扁平疣主要感染的HPV基因型以低危型HPV6、11为主，其中以HPV11为明显优势；但由于本研究未能检测所有的HPV亚型，无法确定以往关于扁平疣研究中所检测到的HPV亚型是否也是四川地区的优势亚型。2扁平疣皮损中多重感染发生率高：本研究发现扁平疣组织中存在HPV高一低危型、低一低危型两种不同形式的多重感染。多重感染率高达34.79%，其中二重感染最多。本文还显示低危型HPV11半数以上参与混合感染，其混合感染率为53.33%；高危型H

17、PV18、HPV59也主要以混合感染形式存在，混合感染率达到54.54%。与尖锐湿疣皮损的研究结果相近9。 综上，通过对扁平疣组织HPV基因型的检测可以了解患者所感染的病毒类型，为治疗方案的选择提供参考，还可为HPV 疫苗的研制提供依据，但由于本研究样本量相对较少，且患者多来自四川地区，而人乳头瘤病毒的感染有一定的地域差异性，需在今后的工作中扩大样本量做更深入广泛的研究。 参考文献 1Sterling JC，Handfield-Jones S，Hudson PM. Guidelines for the management of cutaneous wartsJ.Br J Dermatol，2

18、001，144（1）： 4-11. 2De Villiers EM. Human papillomavirus infection in skin cancersJ.Biomed Pharmacother，1998，52（1）：26-33. 3Ishiji T. Molecular mechanism of carcinogenesis by human papillomavirus- 16J.J Dermatol，2000，27（2）： 73- 86. 4HoonYoo， Sung-Sik Won， Hyun-Chul Choi，et al.Detection and identificat

19、ion of human papillomavirus types isolated from Korean patients with flat wartsJ.Microbiol Immunol，2005，49（7）：633-638. 5余元勋. 用34种探针对疣的人乳头瘤病毒分型研究J.当代医师杂志，1997，1（2）：9-10. 6Prose NS， Knebel-Doeberitz C von， Miller S， et al. Widespread flat warts associated with human papillomavirus type 5： a cutaneous manifestation of human immunodefic