微生物遗传与育种

1、微生物遗传与育种实验指导书实验一、-半乳糖苷酶基因（lacZ）转化入E.coli DH51实验任务和目的1) 掌握转化的实验操作技术。2) 掌握重组菌株筛选的一般原理。2 实验原理在基因克隆技术中，转化(transformation)特指以质粒DNA或以它为载体构件的重组子导入细菌的过程。转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌

2、内。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。其原理是细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗Dnase的羟基- 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105106个转化子，环化重组

3、子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。在Ca2+的基础上，联合其它二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，使可转化率提高1001000倍。基因克隆的最后一道工序就是从转化的细菌菌落中筛选含有阳性重组子的菌落并鉴定重组子的正确性。当带有Lac基因的质粒转化入DH5后，质粒表达-肽，它与宿主菌中F因子上的lacZM15基因的产物互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现蓝色；因此可以筛选出重组菌。 3 试验材料基因材料：环形质粒pT7blue (Novagentech 公司提供，-20

4、保存)宿主：感受态大肠杆菌DH5（-80保存）。试剂：SOC培养基（-80保存）、LB培养基、氨苄青霉素（25mg/mL）（-20保存）、Xgal（ 200mg/mL，-20保存）。4 实验方法4.1 培养基制备LB平板培养基：10.0g胰蛋白胨（Tryptor peptone）、5.0g酵母提取物（Yeast extracting power）、5.0g NaCl、15琼脂糖（Agar power）80溶解后定容1000mL，121灭菌20min，冷却到60左右加入2.5ml氨苄青霉素（25mg/mL），按20ml/个倒平板备用。4.2 转化取10ul环形质粒pT7blue加入到冰上已解冻的

5、装有感受态大肠杆菌DH5 Eppendoff 管中，轻轻混匀，冰上放置30min，42热休克2min，冰上放置至少1min，加入冰上解冻的SOC培养基900ul，30培养至少1h。4.3 筛选向含氨苄青霉素的LB平板培养皿中加入50ul Xgal涂抹平板，浸润30min，加入100ul重组大肠杆菌液涂LB平板。Eppendoff管中剩余的900ul重组大肠杆菌DH5在4 15,000g离心 1min，倒掉上清液约800ul，微型震荡仪上悬震菌体沉淀，吸取菌悬液涂另一LB平板。涂好后的平板在37培养15h左右，挑选蓝色菌落。5 实验结果实验二、-半乳糖苷酶基因（lacZ）插入突变1实验任务和目的

6、1) 掌握质粒的提取和限制性内切酶、连接酶的使用。2) 掌握插入突变的的基本原理及突变子的筛选。2 实验原理pT7Blue是专用商品名称(图2-12)，系Novagentech公司发展的一类由pUC19载体派生而来的质粒载体，含有pUC19的高拷贝复制起点和lac序列、一个 T7 启动子 , f1复制起点以及多克隆位点区段(Hind III - EcoR I)，同时还引入了氨苄青霉素抗性基因（Ap）和大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码的-肽的DNA顺序。其中编码Lac基因的-肽的顺序中含有多克隆位点(Hind III - EcoR I)，当无外源DNA片段插入时，质粒表达-肽

7、，它与宿主菌中F因子上的lacZM15基因的产物互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现蓝色；外源基因的插入后，当Lac-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色。3 试验材料基因材料：含HindIII酶切位点的一段1.5kb的外源DNA；环形质粒pT7blue （试验一重菌中提取）宿主：感受态大肠杆菌DH5（-80保存）。试剂：SOC培养基（-80保存）、LB培养基、氨苄青霉素（25mg/mL）（-20保存）、Xgal（ 200mg/mL，-20保存）。Wizard Plus SV Cell Resuspension S

8、olution、Wizard Plus SV Cell Lysis Solution、Wizard Plus SV Column Wash Solution、Wizard Plus SV Alkaline Protease Solution、Wizard Plus SV Neutralization Solution、Wizard Plus SV Nuclease-Free Water、内切酶Hind、10M缓冲液、10loading缓冲液、倍稀释的Hind标准DNA分子4 实验方法4.1 培养基制备LB平板培养基：10.0g胰蛋白胨（Tryptor peptone）、5.0g酵母提取物（Ye

9、ast extracting power）、5.0g NaCl、15琼脂糖（Agar power）80溶解后定容1000mL，121灭菌20min，冷却到60左右加入2.5ml氨苄青霉素（25mg/mL），按20ml/个倒平板备用。LB大肠杆菌培养基：10.0g胰蛋白胨（Tryptor peptone）、5.0g酵母提取物（Yeast extracting power）、5.0g NaCl ，80溶解后定容1000mL，试管分装2ml/管，121灭菌20min，冷却后加入5.0ul/管氨苄青霉素（25mg/mL）备用。4.2 重组大肠杆菌培养将LB液体培养基分装入试管中，每管2ml，121，灭

10、菌20min，冷却后每管加入5ul氨苄青霉素（25mg/ml）。用无菌牙签挑取试验一的篮色的单菌落接种于试管中，37 150rpm震荡培养15h左右，直至细菌悬浊液浓度达到OD600为0.450.55(细菌的对数生长期)，一般认为从试管另一面看不到牙签即可。4.3质粒pT7Blue提取(1) 大肠杆菌细胞的裂解：将.4步培养的大肠杆菌转移入无菌的1.5ml的Eppendorf中, 10,000g 离心5min，弃上清，每管加入250ul Cell Resuspension Solution 充分振荡悬浮菌体沉淀。再向每管加入250ul Cell Lysis Solution ,倒转4次轻微混匀

11、，加入10ul Alkaline Protease Solution 倒转4次混匀，室温（约24）保温5min。再加入350ul Neutralization Solution 立即倒转4次混匀，室温，14,000g 离心10min。 (2) 质粒的收集：将无菌的Spin Column收集柱插入无菌的2.0ml收集管中，将上步离心后的裂解上层液缓慢的注入Spin Solution柱子中，室温，15,000g 离心1min。弃滤液，将Spin Solution柱子重新插入收集管中。(3) 清洗质粒：向Spin Solution柱子中加入750ul调配好的Wash Solution洗液，室温，15

12、,000g 离心1min，弃滤液。再将Spin Column收集柱插入收集管中，再向Spin Solution柱子中加入250ul调配好的Wash Solution洗液，室温，15,000g 离心2min，弃收集管。(4) 质粒的洗脱：将Spin Solution柱子重新插入新的1.5ml的Eppendorf管中，向Spin Solution柱子中加入100ul的Nuclease-Free Water, 室温，15,000g 离心1min，弃Spin Solution柱子。盖好Eppendorf管盖，-20或更低的温度保存备用。DNA在4的1TE缓冲液中也很稳定，如果要在4保存质粒DNA，则须

13、向含100ul质粒DNA的Eppendorf管的加入11ul的10TE缓冲液。(5) 限制性内切酶处理质粒DNA：在1.5ml的Eppendorf管中加入灭菌水15ul/管、10M缓冲液2ul/管和酶Hind 1ul/管或酶EcoR1ul/管，然后再加入质粒DNA 2ul/管，用手指轻轻弹匀，小型离心机上离心使管壁上的液体落入管底，37酶切1h，电泳。4.4 外源DNA的酶切限制性内切酶处理外源DNA：在1.5ml的Eppendorf管中加入灭菌水10ul/管、10M缓冲液2ul/管和酶Hind 1ul/管或酶EcoR1ul/管，然后再加入质粒DNA 8ul/管，用手指轻轻弹匀，小型离心机上离

14、心使管壁上的液体落入管底，37酶切1h，电泳，胶回收。4.5 插入突变和转化 从DNA ligation Kit Ver.2 solution试剂盒取10ul连接缓冲液加入到100ul的Eppendoff 管中。然后加入酶切后的胶回收的外源DNA片段9ul，再加入酶切后的pT7blue载体 1ul ，轻轻混匀后（注：以上顺序不能颠倒）在PCR仪中16连接30min。连接结束后取10ul重组质粒DNA加入到冰上已解冻的装有感受态大肠杆菌DH5 Eppendoff 管中，轻轻混匀，冰上放置30min，42热休克2min，冰上放置至少1min，加入冰上解冻的SOC培养基900ul，30培养至少1h。4.6 筛选向含氨苄青霉素的LB平板培养皿中加入50ul Xgal涂抹平板，浸润30min，加入100ul重组大肠杆菌液涂LB平板。Eppendoff管中剩余的900ul重组大肠杆菌DH5在4 15,000g离心 1min，倒掉上清液约800ul，微型震荡仪上悬震菌体沉淀，吸取菌悬液涂另一LB平板。涂好后的平板在37培养15h左右，挑选白色菌落即为-半乳糖苷酶基因（lacZ）突变株。5 实验结果外源DNADNA Ligation Kit Ver.2 solutionI