木犀草素对卵巢癌细胞株转移能力的影响_肖大凯_图文

1、收稿日期2004-09-15 修回日期2004-12-17*基金项目广东省重点学科课题资助(No.9306;广东省中医药管理局科研基金资助项目(No.300009Tel:0759-*;E-mail:ncliang文章编号 1000-4718(200606-1199-04木犀草素对卵巢癌细胞株转移能力的影响*肖大凯1,3, 覃燕梅1, 莫丽儿2, 梁念慈1,2(1广东医学院生化教研室,2广东天然药物研究开发重点实验室,广东湛江524023;3上海第二医科大学附属瑞金医院,上海血液学研究所,上海200025摘 要 目的:研究木犀草素对卵巢癌细胞株HO-8910PM 的体外侵袭能力的影响,并探讨其可

2、能的作用机制。方法:HO-8910PM 细胞经木犀草素处理后用Boyden 小室法检测其体外、侵袭和运动能力。并采用明胶酶谱法检测HO-8910P M 细胞分泌的明胶酶活性。RT-PCR 检测TIMP-1、NM 23基因mRNA 的表达情况,蛋白印迹法检测ERK2的蛋白表达变化。结果:HO-8910PM 细胞经木犀草素处理后,体外侵袭、运动能力呈剂量依赖性下降。HO-8910PM 细胞MMP-9的分泌下降。ERK2蛋白表达明显降低,但TIMP-1、NM23基因mRNA 的水平无明显变化。结论:木犀草素在体外剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞HO-8910PM 的转移能力,这可能与木犀草素抑制MMP-9

3、的分泌及下调ERK2表达有关。关键词 木犀草素;卵巢肿瘤;基质金属蛋白酶;肿瘤转移 中图分类号 R363 文献标识码 AEffect of luteolin on metastasis of ovarian carcinoma cell lineXIAO Da-kai 1,3,QIN Yan-mei 1,MO Li-er 2,LIANG Nian-ci1,2(1Department o f Biochemistry ,Guangdon g Medical Colle ge,2Guan gdong Key Laboratory f or Resea rch and Development o f

4、 NaturalDrugs ,Zhanjiang 524023,China ;3Shanghai Institute of H e matology ,Shan ghai Second Me dical School a ff ilia ted Ruijin H ospital ,Shan ghai 200025,ChinaABSTRAC T AIM:To explore the effect of luteolin on the metastasis of ovarian carcinoma HO-8910PM cells in vitro ,and to elucidate its mec

5、hanisms.METHODS:The in vitro invasion and mobili ty of HO -8910PM were measured by Boyden chamber assay after exposure to luteolin for 6h.Gelati nase activi ty was tested by gelatin zymography assay.The expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-1(T IMP-1,nm23mRNA and that of ERK2protein we

6、re tested by RT-PCR and Western blot -ting,respectively.RESULTS:Lu teolin significantly inhibi ted in vitro invasiveness and mobility in HO -8910PM cells in a dose dependent manner as measured by Boyden chamber assay.Luteolin inhibi ted the MMP-9secretion from HO-8910PM cells.Lute -olin did not affe

7、ct the mRNA expression of TIMP-1and n m23.Luteolin also decreased ERK2expression.CONCLUSION:Lute -olin dose-dependently inhibited the metastasis of HO-8910PM cells in vitro .Inhibition of MMP-9secreti on and ERK2expres -sion may be involved in the anti-metastasic process of luteolin.KEY WORDS Luteol

8、in;Ovarian neoplasms;Matrix metalloproteinases;Neoplasms metastasis卵巢癌是目前病死率最高的妇科恶性肿瘤之一,肿瘤转移是卵巢癌患者恶化及术后复发和致死的主要原因之一,寻找特异性抑制肿瘤细胞转移的靶向药物成为近几年抗肿瘤药物开发的热点。木犀草素(luteolin是一种广泛分布于植物界的黄酮类化合物,在日常饮食中的含量也极为丰富,药理作用多样,如抗癌、抗炎症和抗过敏、抗氧化等。体外研究发现木犀草素能够抑制乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤及白血病等多种肿瘤细胞株的生长,并能够诱导白血病细胞的凋亡1。本实验以在体内已经证实有高转移能力的人卵巢

9、癌细胞株HO-8910PM 作为实验对象,观察木犀草素对肿瘤转移体外模型的影响,为开发临床抗肿瘤药物提供实验依据。材 料 和 方 法1 主要试剂逆转录试剂盒购自Promega 公司;总RNA 提取#1199#中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2006,22(6:1199-1202试剂盒Trizol Rea gent 购自Gibco 公司。木犀草素购自Sigma,Matrigel 购自BD 公司,纤维连接蛋白(f-i bronectin,FN购自北京医科大学生物系。ECL 试剂购自Santa Cruz 公司。聚碳酸酯膜购自Millipore

10、。2 细胞株人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM 由浙江省肿瘤研究所许沈华等2建立,常规培养,取对数生长期的细胞进行实验。3 木犀草素细胞毒性实验处于对数生长期的HO-8910PM 细胞,经过不同浓度药物和D MSO(011%处理6h 后,台盼蓝拒染法在镜下记活细胞数,计算不同浓度的药物对细胞的生长抑制率。4 重组基底膜侵袭实验3 聚碳酸酯膜的外表面涂FN 5L g,膜内表面涂matrigel 20L g,形成人工重组基底膜;将涂好的膜贴在Boyden 上室,在下室加入011%BSA -RP MI -1640;将含有不同药物浓度的总数为2105的细胞悬液200L L 加到Boyden 上室中

11、,细胞培养箱内孵育6h 。取出聚碳酸酯滤膜,擦尽膜上Matrigel 及未穿过的细胞。甲醇固定1min,HE 染色。200倍显微镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野,每组平行设3个样本。5 细胞运动能力的测定3运动实验与重组基底膜侵袭方法相似,只是聚碳酸酯膜内表面上不需铺matrigel 。6 明胶酶谱分析3木犀草素作用于细胞24h 后,收集上清,将培养瓶中的细胞消化,台盼蓝拒染法进行活细胞计数。按活细胞数换算成无血清培养上清的体积。 底物酶谱分析参照文献3,SDS-PAGE 分离胶中含有011%的明胶,调整各无血清培养上清样品的体积,使其所对应的活细胞数相同,4

12、e 恒流15mA 电泳,完毕后凝胶移至100mL 215%Triton X-100溶液中,洗脱SDS 。加入明胶酶缓冲液,37e 恒温摇床中温浴40h,染色3h,脱色液中脱色至对照出现清晰的负染带。7 逆转录PCR(RT-PC R总RNA 的提取按照Trizol 试剂盒方法操作。c D -NA 第一链合成按照试剂盒操作手册操作。GADP H (扩增产物长度450bp,作为内参照正向引物:5.-ACC ACA GTC C AT GCC ATC AC-3.;反向引物:5.-TCC ACC ACC C TG TTG C TG TA-3.。TIMP-1(扩增产物长度303bp正向引物:5.-C TT

13、CC A CAG GTCCCA CAA CC-3.;反向引物:5.-CAG CCC TGG C TC CCG AGG C-3.。nm23H1(扩增产物长度185bp正向引物:5.-AGG GCA GAC CAC ATT GC T TTT C-3.;反向引物:5.-GC T GGG AGG AAG C AT TTT AAT C-3.。反应参数:热启动94e ,2min;94e 1min,58e 1min;72e 1min,共35循环。72e 延伸10min 。琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果、拍照。8 蛋白印迹木犀草素作用细胞24h 后提取总蛋白。考马斯亮蓝法行蛋白定量。等量蛋白按照顺序上样,1

14、20V 恒压电泳115h (MINI -PROOTEAN Ò型电泳仪。4e 恒流90mA 条件下12-16h 电转至PVDF 膜。转移好的膜经过011%丽春红染色确定转移效率及蛋白质marker 位置。PVDF 膜经新鲜配制的封闭液(1TB S,5%脱脂奶粉,0105%Tween-20封闭后,分别与Ñ抗溶液(兔抗E RK2用封闭液1B 1000稀释、Ò抗溶液反应,清洗,最后进行ECL 试剂发光,X 光片曝光显影。9 统计学处理本实验数据资料用 x ?s 表示,SPSS 1010统计软件进行单因素方差分析。结 果1 木犀草素对卵巢癌细胞HO-8910PM 转移能力的

15、影响HO-8910P M 细胞经10-40L mol/L 的木犀草素作用6h 后,细胞侵袭人工重组基底膜的能力和体外运动能力明显降低,这种抑制作用随着木犀草素的浓度的增加而增强。木犀草素浓度为40L mol/L 时,对细胞体外侵袭人工重组基底膜和运动能力的抑制率分别为(6519?716%和(6813?410%,与对照相比,差异显著(P <0101(图1。为了排除木犀草素细胞毒性对实验结果的影响,采用台盼蓝拒染法检测木犀草素作用6h 对细胞生长的影响,结果表明10-40L mol/L 的木犀草素作用6h 对细胞的生长无影响(图1。2 木犀草素对细胞分泌的明胶酶活性的影响 处于对数生长期的H

16、O-8910PM 细胞改用无血清培养基,同时加入木犀草素,作用24h 后,用明胶酶谱法分析条件培养基中明胶酶的活性。结果表明,HO-8910PM 能够分泌分子量为92kD 左右MMP -9。木犀草素作用24h 可以明显抑制MMP-9的分泌。见图2。#1200#3 木犀草素对TIMP-1、nm23H1mRNA 表达的影响不同浓度的木犀草素作用于HO-8910PM 24h 后,用RT-PCR 的方法检测TI MP-1、nm23H1mRNA 的表达情况。结果显示:与内参照GADPH 比较,木犀草素作用后对TI MP-1、nm23H1mRNA 表达无明显影响。见图3、4 。Fig 1 Effect o

17、f luteolin on the growth,invasion and mobili ty of HO-8910PM after 6h treatment.*P <0105,vP <0101vsDMSO.图1 不同浓度木犀草素对HO-8910PM 细胞生长、体外侵 袭和运动能力的抑制作用Fig 2 Effect of luteolin on the activity of MMP-9secreted by HO-8910PM.1:control;2:DMSO (011%;3:10L mol/L;4:20L mol/L;5:40L mol/L.图2 木犀草素对HO-8910PM

18、细胞的MMP-9 分泌影响Fig 3 Effect of luteolin on the expression of TIMP-1for 24h treat -ment.1:DNA maker;2:control;3:D MSO (011%;4:10L mol/L;5:20L mol/L;6:40L mol/L.图3 木犀草素对HO-8910PM 细胞TIMP-1m RNA 表达 的影响4 木犀草素对ERK2蛋白表达的影响不同浓度的木犀草素作用于HO-8910PM 24h 后,蛋白印迹结果表明,木犀草素显著下调E RK2的表达。见图5。Fig 4 Effect of luteolin on t

19、he expression of NM23H1for 24htreatment.1:DNA marker;2:control;3:D MSO(011%;4:10L mol/L;5:20L mol/L;6:40L mol/L.图4 木犀草素对HO-8910PM 细胞NM23H1m RNA 表达的影响Fig 5 Effect of luteolin on the expression of ERK2after 24h treat -ment.1:control;2:DMSO (011%;3:10L mol/L;4:20L mol/L;5:40L mol/L.图5 不同浓度木犀草素对HO-8910P

20、M 细胞ERK2蛋白表达的影响讨 论侵袭转移是恶性肿瘤的本质特性,转移瘤的快速增殖、多灶性分布、异质性生长是目前手术、放射治疗和化学治疗等手段常遭受失败并最终导致癌症病人死亡的主要原因,抑制肿瘤的侵袭转移是降低肿瘤死亡率的重要途径。目前认为,肿瘤细胞需要经过粘附、分泌蛋白水解酶、运动等3个主要步骤完成向深层侵袭的过程。对肿瘤侵袭转移机制的深入了解,为肿瘤侵袭转移的防治提供了新的思路,寻找抑制肿瘤转移各步骤的抑制剂,抑制肿瘤的转移,是抗癌药物研究的新方向。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs是一类降解细胞外基质Zn 2+依赖的内源性蛋白水解酶。金属蛋白酶组

21、织型抑制剂(tissue inhibitor of met -alloproteinases,TI MPs是MMPs 的天然抑制剂,MMPs/TI MPs 的比例对于维持基底膜和细胞外基质的代谢平衡4和肿瘤细胞的转移具有重要影响5。已经证实木犀草素是拓扑异构酶的抑制剂,能够抑制肿瘤细胞的增殖。而我们发现,木犀草素在#1201#并不影响细胞活性的情况下,能够抑制卵巢癌细胞转移过程中的侵袭、运动环节,说明木犀草素具有抑制卵巢癌细胞转移的能力。进一步的实验结果表明,木犀草素可以显著抑制HO-8910PM 分泌MMP -9,但对MMP-9内源性抑制剂TI MP-1的表达无明显影响,提示抑制MMP-9的

22、分泌可能是木犀草素抑制卵巢癌细胞体外侵袭能力的机制之一。 信号转导系统中的多种激酶在肿瘤细胞的转移过程中具有重要作用。PKC 、MAPK 、PI3K 等激酶作为中枢分子通过作用于下游效应分子对肿瘤细胞的侵袭转移行为进行调控。细胞外调节蛋白激酶包括ERK1和ERK2,是MAPK 信号转导通路中相当重要的一个环节,ERK1、ERK2一旦被激活,可以磷酸化一系列的胞浆蛋白,也可以移位至细胞核,活化多种转录因子,进而影响各种基因的表达。ERK2激活能增强乳腺癌细胞MCF-7的运动能力6和侵袭细胞外基质的能力7,特异性地抑制ERK 的激活能够降低头颈腺癌的体内侵袭能力8,并且能够抑制MMP-9的表达9,

23、说明ERK 在肿瘤侵袭、运动过程发挥重要作用。我们的实验结果表明木犀草素能够明显地抑制ERK2的表达,由此我们推断,抑制ERK 的表达可能参与了木犀草素抑制卵巢癌细胞转移的过程:木犀草素可能通过抑制ERK,下调MMP-9的分泌,进而抑制卵巢癌细胞的侵袭,或抑制卵巢癌细胞的运动,从而抑制整个转移过程。但其深入的机制及体内的作用效果尚需进一步研究。参 考 文 献1 Kang TB,Liang NC.Effect of luteolin on activities of proteinkinase C and tyrosine protein kinase from HL -60cellsJ.Act

24、a Pharmacologica Sinica,1997,18(4:374-376.2 许沈华,牟瀚舟,钱丽娟,等.高转移人卵巢癌裸鼠移植瘤模型(NMSO的建立及其生物学特性J.中华病理学杂志,1996,25(1:33-35.3 韩 锐.抗癌药物研究与实验技术M.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997.353-362.4 刘金来,关良劲,谢旭晶,等.急性冠状动脉综合征患者血浆基质金属蛋白酶及其抑制因子的变化J.中国病理生理杂志,2004,20(10:1921-1922.5 肖大凯,梁念慈.Ô型胶原酶的研究进展J.国外医学:临床生物化学与检验学分册,2001,22(5:225-227.6 Nguyen DH,Hussaini IM,Gonias SL.Binding of urokinase-type plasminogen activator