术前化疗对Ⅲ期NSCLC基因变异的作用及其临床意义

1、    术前化疗对期NSCLC基因变异的作用及其临床 意义        摘要：目的通过检测术前化疗与单一手术组织标本之间多种癌基因与抑癌基因分子变异的差异，以期探讨术前化疗对期NSCLC患者基因变异的影响及其临床意义。方法分别采用DNA印迹法及PCR技术，检测75例期NSCLC组织DNA标本中c-myc、c-erbB2及EGFR多种癌基因扩增及71例组织中抑癌基因p15的纯合性丢失。结果1)术前化疗组的多种癌基因共扩增率为35.5%，而相应单一手术组为63.6%(

2、P0.05)。2)p15的纯合性丢失率在术前化疗组为23.3%，较单一手术组的70.7%有显著性降低(P0.001)。结论术前化疗对期NSCLC患者癌细胞具有攻击及杀伤作用，从而不仅使癌基因的共扩增率下降，而且也使抑癌基因的丢失率降低。因此检测基因的变化在一定程度上有可能作为术前化疗对于期肺癌治疗有效性的实验室预测指标。关键词：肺肿瘤/治疗；药物疗法；外科手术；癌，非小细胞肺；癌基因；抑癌基因中分类号：R730.53文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)05-0385-03THE EFFECT OF PREOPERATIVE CHEMOTHERAPY ON GENES IN P

3、ATIENTS WITH STAGE NSCLC AND ITS CLINICAL IMPLICATIONSGU Ma-lin,ZHANG Hua, LIAO Mei-lin,et al.(Shanghai Cancer Insititute, Shanghai 200032,China)Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of preoperative chemotherapy on the alteration of oncogenes and tumor suppressor genes in locally advanced NSCL

4、C and its clinical significance.MethodsCo-amplification of oncogenes were evaluated by Southern blot and slot blot for 75 patients with stage NSCLC and homozygous deletion of MTS2/p15 gene was determined by PCR(Polymerase chain reaction) for 71 patients. Results1) The rate of co-amplification in sta

5、ge NSCLC patients with chemotherapy was 35.5%, while that in stage NSCLC without chemotherapy was 63.6%. 2) the rate of p15 gene homozygous deletion in group with chemotherapy (23.3%) was dramatically lower than in group without chemotherapy (70.7%,P0.001). ConclusionPreoperative chemotherapy plays

6、an important role in treatment of stage NSCLC patients. By attacking and killing the cancer cells, preoperative chemotherapy not only can lower the rate of oncogenes co-amplification, but also the rate of p15 gene homozygous deletion. Therefore, detection of genes alleration may be used as a potenti

7、al predictor for evaluating preoperative chemnotherapy in treatment of stage NSCLC patients.Key words：Lung neoplasms/treatment;Drug therapy；Surgical operation;Carcinoma,non-small-cell lung;Oncogenes;Tumor suppressor gene随着环境的污染以及吸烟人群的增加，导致肺癌的发病率逐年增高并居上海市所有恶性肿瘤死亡率的首位，从而严重地危害人民的生命健康，因此肺癌的基础及临床研究日益受到人们

8、的密切关注及重视。NSCLC占肺癌80%以上，因此对于NSCLC的研究就更具有重要的临床价值。化学药物早已被人们作为治疗恶性肿瘤的主要手段之一，然而术前化疗是近几年刚开展的新综合治疗的一个组成部分。该治疗方法的重要价值在于使肿瘤原发灶及其浸润范围缩小，为手术治疗创造条件，提高手术切除率并有利于消除原发病灶以外的微小病灶，以减少术后播散及提高生存率，据报道NSCLC单一手术组的死亡危险是术前化疗组的五倍1，2。林震琼等3曾从病理形态学出发，分析术前化疗对NSCLC的作用，结果发现期NSCLC患者作术前化疗的手术标本约有23.8%可转化为P期(病理分期)，从而提示通过术前化疗可出现组织形态病理分级

9、降低的现象，但是否能出现癌基因及抑癌基因的变异至今尚未见报道。为此，本文拟从分子水平通过检测术前化疗组及非化疗组NSCLC组织标本中多种癌基因(C-myc、C-erbB2及EGFR)活化及p15抑癌基因丢失之间的差异，以期探讨术前化疗对期NSCLC组织中基因的变异及其临床应用意义。材料与方法一、组织标本19951998年期间收集经病理证实的75例非小细胞肺癌新鲜手术标本其中31例患者术前经化疗处理，采用MVP方案(丝裂霉素、长春新碱、顺铂)23个周期。所有患者均属上海市区居民并主要来自于上海市胸科医院及上海市肺科医院。新鲜组织标本均在手术切除后1 h内放于液氮内深低温保存，以防组织自溶。二、D

10、NA纯化DNA纯化步骤基本参照Maniatis氏等分子克隆技术并结合本实验室改良方法。三、基因检测步骤采用DNA印迹法(Southern blot及slot blot)检测每份非小细胞肺癌组织DNA中c-myc、c-erbB2及EGFR多种癌基因扩增；采用聚合酶链反应(PCR)技术检测抑癌基因p15的纯合性丢失。四、基因探针及引物癌基因探针均由日本国家癌症研究所基因库馈赠，其中各类基因探针分子量c-erbB2为3.0 kb，c-myc为8.5 kb，EGFR为2.4 kb。PCR扩增时的引物：p15基因外显子(Exon 2)及内对照-actin基因的引物均由中科院细胞生物学研究所合成。p15基

11、因外显子2(exon2)引物序列如下：sense 5-TGGCTCTGACCACTCTGC；antisense 5-AGCGAATTCGGGTGGGAAATTGGGGTAAGAA。-actin基因的引物序列如下：sense 5-GAAACTACCTTCAACTCCATC；antisense 5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC五、资料统计处理采用2检验。结果一、期NSCLC中多种癌基因的共扩增对75例期NSCLC肺癌组织DNA标本采用DNA印迹法并分别以单个标本对C-myc、C-erbB2及EGFR基因同时作多基因扩增检测(Coamplification of

12、 oncogenes)。判断标准以三种癌基因中至少有两个基因扩增作为阳性。实验结果(见表1)表明术前化疗后癌基因共扩增率为35.5 %，较单一手术组63.6 %低，且有统计学意义(P0.05)。二、期NSCLC与p15基因纯合性丢失的相关性研究经采用PCR法并结合p15基因外显子2引物，分别对71例期NSCLC患者作基因纯合性丢失检测，以期了解p15基因失活在两组标本中的差异。实验结果(见表2)表明经过术前化疗p15基因纯合性丢失率有显著降低，且有统计学意义。 表1两组期NSCLC多基因共扩增分组总例数c-myc、c-erbB2及EGFR共扩增阳性数阴性数阳性率(%)术前化疗组31112035

13、.5单一手术组44271763.6?P0.05 表2两组NSCLC中p15基因纯合性丢失分组总例数p15基因纯合性丢失阳性数阴性数阳性率(%)术前化疗组3072323.3单一手术组41291270.7?P0.001 讨论当今术前化疗作为综合治疗的一个重要部分逐渐被人们所接受并成为一种发展趋势，它能使原发病灶及其浸润范围缩小，为手术治疗创造条件，进而可对期肿瘤患者采取包括外科手术在内的多学科治疗，从而能极大地改善患者的预后。关于化疗后肿瘤组织分子遗传学方面的变化也有报道，包括p53、p21及bcl-2的基因表达在头颈癌辅助化疗前后的变化等4，5。myc基因产物是一种能与DNA分子结合的蛋白质，它

14、是一种转录活化因子(transcriptional activator)。在肺癌中myc基因活化的一般机制是基因扩增而导致的过度表达，一旦myc蛋白增加，可刺激细胞增生以最终恶变。临床研究提示，几乎所有的小细胞肺癌及大多数非小细胞肺癌组织中均可出现myc基因族中任何一种基因的变异，NSCLC中约有40%50%出现c-myc基因的基因扩增及高表达，这类患者预后差，生存期短6。c-erbB-2与EGFR均属于表皮细胞生长因子受体，这类基因的过度表达在某些人类恶性肿瘤的发生发展、肿瘤的恶性程度及癌症患者低生存率之间存在密切的相关性。文献报道腺癌中有83%出现上述基因的共扩增并与病人的不良预后有关7。

15、本实验室曾对62例非小细胞肺癌新鲜组织标本进行c-myc、c-erbB2及EGFR三种基因扩增检测，结果提示多种基因的共扩增率与病理分期呈正相关(P0.05)8。为此本文也采用上述方法检测及分析经术前化疗或未化疗的期NSCLC手术标本之间的分子变异，实验结果表明术前化疗后癌基因共扩增率为35.5%，较未化疗组63.6%明显降低并有统计学意义(P0.05)。这一结果充分说明术前化疗对期NSCLC患者的癌细胞具有攻击及杀伤作用，因此有效地降低了癌基因的共扩增率。1994年以来，p16、p15基因分别从人类染色体9p21-22区处分离及纯化，并发现该基因属CDK4和CDK6(cyclin-depen

16、dent kinase)的抑制因子，称为MTS1及MTS2。其基因表达产物可与CDK4-cyclin D复合物结合，使CDK4激活功能丧失，阻滞细胞进入G1/S期，抑制细胞过度生长。一旦p16，p15基因丢失或突变，失去对CDK功能的抑制从而促使细胞无限制地进入G1/S期并加快细胞分裂，最终导致细胞永生化而形成肿瘤细胞。Washimi等9证实非小细胞肺癌细胞株及原发性非小细胞肺癌组织均可出现p15及p16基因的纯合性共丢失现象。本文采用PCR技术通过检测p15基因纯合性丢失比较研究术前化疗及单一手术在期NSCLC中基因丢失情况，结果表明经过术前化疗p15基因纯合性丢失率由未化疗时的70.7%降

17、为23.3%。由此可见，本文进一步从分子水平证实了术前化疗具有促使某些中晚期肺癌患者组织形态学恶性程度下降的作用。上述结果充分表明，术前化疗对期NSCLC患者癌基因及抑癌基因的变异具有明显的作用。通过术前化疗杀伤癌细胞，既能使癌基因的共扩增率明显下降，又能导致抑癌基因的纯合性丢失率降低，因此有可能从分子水平上阻滞肿瘤细胞发展进程10。更为重要的是根据本文的初步结果可提示分子生物学研究有可能为期NSCLC患者采用术前化学药物治疗在临床上的有效性提供实验依据。至于对某些经术前化疗而导致分子生物学行为改变的期NSCLC患者的预后疗效及生存率还有待于今后随访追踪。(本文编辑：马积庆)作者简介：顾马林，

18、男，大专，助理研究员。顾马林（上海市肿瘤研究怕上海 200032）张华（上海市肿瘤研究怕上海 200032）廖美琳（上海市胸科医院）赵明（上海市肿瘤研究怕上海 200032）周瑾（上海市肿瘤研究怕上海 200032）许凯黎（上海市肿瘤研究怕上海 200032）参考文献1Rosell R, Comez-Codina J, Camps C, et al. A randomized rtrial comparing pre-operative chemotherapy plus surgery with surgery alone in patients with non-small cell lu

19、ng cancerJ. N Engl J Med,1994,330:1532Roth J, Fossella F, Komaki R, etal. A randomized trial comparing pre-operative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage A non-small cell lung cancerJ. J Natl Cancer Inst,1994,86:6733林震琼.肺癌治疗后的病理形态学M.见：廖美琳主编.肺癌现代治疗M.第1版，上海：上海医科大学出版社，1998：15

20、34Cabelguence A, Blons H, de Wazier I, et al. p53alterations predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy in head and neck squamous cell carcinoma:a prospective seriesJ. J Clin Oncol,2000,18(7):14655Ashktorab H, Larbi D, Schwartz J, et al. Expression of p53, p21 and bcl-2 before and after trimetrexate based neoadjuvant chemotherapy for head and neck cancerC.The