植物细胞的蛋白质分选研究

1、 植物细胞的蛋白质分选研究 02级 生物科学班 潘俊莲（0242043011）摘要：在生物体内，细胞各部分都有其特定的蛋白质组分，而由于蛋白质的合成位点与其功能位点往往不一致，就产生了蛋白质分选，转运的问题。一般来说，蛋白质转运可分为两大类：一，蛋白质的合成，转运是同时发生的，即翻译运转同步机制；二，蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，即翻译后运转机制。在植物细胞中，分泌蛋白大多以翻译运转同步机制运输，如水解酶，激素等；由细胞质进入细胞器的蛋白多以翻译后运转机制运输，如细胞核，叶绿体，线粒体等里面的蛋白质；而参与生物膜形成的蛋白，则依赖于上述两种机制嵌入膜内，如ER，质膜中的蛋白质。而他们在细胞

2、中的定位和分泌依赖于特定的短肽链，N端的转运短肽提供了蛋白质进入ER腔，线粒体，叶绿体等细胞器的信号，然后这些转运肽在蛋白质进入特定位置后被剪切，C端的转运短肽引导一些蛋白质进入微粒体和液泡中。蛋白质转运进入核内以及定位于膜上的信号是由残留在成熟蛋白质中的特殊序列提供的。关键词：蛋白质分选 转运肽 翻译运转同步机制 翻译后运转机制一.分泌途径的蛋白质转运：翻译运转同步机制 生活的植物细胞在不断的分泌各种各样的酶和组成细胞壁的结构蛋白以及细胞外基质（ECM）中的一些细胞因子（小分子蛋白质）。整个分泌的过程就是一个细胞内的蛋白质转运过程，包括以下几个步骤：（1）蛋白质通过共转运穿越的方式跨过ER膜

3、。（2）切除信号肽和N端的一些糖基。（3）蛋白质从高尔基复合体的cis面进入高尔基体，然后进行N端糖链的转变和蛋白质的O联糖基化。（4）蛋白质装入小膜泡向液泡和细胞膜运输。（5）小膜泡膜和受体膜融合。在此，我们仅讨论前两个过程。 绝大部分被运入ER内腔的蛋白质都带有一个信号肽，该序列常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在1336个残基之间，有以下特点：（1）一般有1015个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列N端常有1个或数个带正电的氨基酸；（3）在其C末端靠近蛋白酶切割位点处常有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链。信号序列在核糖体上合成后便与信号识别颗粒结合，使翻译暂停，然后

4、信号识别颗粒将引导这个复合物向膜上特定受体靠近，与其相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构。信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP）是一种特殊的翻译调控蛋白因子，也是一种核蛋白，在哺乳动物中SRP复合物大小为11S，含有7S的RNA和6条肽链，而在酵母中的SRP大小为7S，含有4.5S的RNA。而且SRP上面6条肽链各自的功能也已经区分出来了。SRP9和SRP14暂停翻译过程，SRP54识别信号肽，是一种G蛋白，在SRP的功能中起着重要的作用。SRP19连接SRP54和7S RNA，另外的两个肽链SRP68和SRP72将结合了SRP的新生

5、肽链拉向膜上面的转运蛋白。SRP和新生肽链的结合依赖于SRP54的GTP结合活性，当SRP54的G domain发生GDP/GTP交换后，SRP和新生肽链发生高亲和结合。暂停翻译以后，只有当这个结合了SRP的核糖体以及新生肽链共同组成的巨大复合物触发了膜上面的SRP受体后，翻译延伸过程才能继续。SRP和他的受体的结合导致构成膜上转运蛋白的一种蛋白质复合物ribophorin的构象改变，同时也使得SRP从核糖体复合物上释放，重新参与翻译循环。SRP受体还会把核糖体压入转运蛋白中，这个处理是具有重要的生物学意义的，因为转运蛋白在关闭时孔道直径只有0.9-1.5nm，而开放的转运蛋白孔道直径达4nm

6、，而这个亲水孔道在转运新生蛋白质时对于离子来说却是关闭的，因为在蛋白质转运中，一种分子伴侣（chaperon）BiP从里面插入转运蛋白，而刚才提到的压入的核糖体从外面封闭转运孔道，这样就使得只有被转运的蛋白质能够穿过转运蛋白而离子被阻挡，这有效地维持了ER膜两侧的离子梯度。SRP从复合物上离开后，新生肽链的信号肽序列也随之被切除，这是由信号肽酶完成的，信号肽酶是一种依赖Zn离子的，由12个不同的亚基组成的异源多聚蛋白酶。但信号序列的切除并不是运转所必需的。如果把细菌外膜脂蛋白信号序列中的甘氨酸残基突变成天冬氨酸残基，则可以抑制该蛋白信号肽的水解，但不能抑制其跨膜运输。此外，并非所有的运转蛋白都

7、有可降解的信号肽：卵清蛋白是以翻译运转同步机制进入微粒体中的，但它并没有可降解的信号序列。图1：蛋白质转移到内质网上合成的过程翻译过程结束，整个蛋白跨膜进入内质网内腔以后，形成高级结构和成熟型蛋白质，再以运转载体的形式被送入高尔基体或形成运转小泡，分别运送到各自的亚细胞位点。在这个过程中，分子伴侣对蛋白质的正确构象起了重大作用。在肽链延伸过程中，他们结合在肽链上，使未合成完毕的蛋白质保持在天然状态，不进行错误折叠。此外，N连糖基也有利于蛋白质分子的正确折叠，这是因为这些亲水的糖基可以保护蛋白质进入的部分疏水残基不会在溶液中聚集成团。这种效果已经通过tunicamycin的作用得到了证明，tun

8、icamycin能够抑制催化甘露糖糖基化过程中第一步反应的酶的活性，使用它抑制糖基化后导致凝聚的蛋白质在ER腔内聚集。不过在植物中对这样的情况有适应性的应答，它们会通过大量合成协助蛋白质折叠的分子伴侣BiP和蛋白质二硫键异构酶来保证生物蛋白质合成的尽可能稳定。蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase ，PDI)是一种折叠酶，它能在体外条件下催化蛋白质分子折叠成为有利于形成天然二硫键所需的构象，而不需要其它分子伴侣的帮助。实验证明PDI分子C末端结构域的多肽结合位点负责其分子伴侣活性。 二.运往个细胞器的蛋白质分选：翻译后运转机制1 线粒体蛋白质的跨膜运转线粒体

9、作为一种半自主性细胞器（semiautonomous organelle），能够自己合成某些蛋白，但所合成的几十种蛋白远不能满足其功能需要，还需要核基因为其编码许多蛋白，然后通过转运输送进线粒体中共同完成ATP合成等生物功能。据报道95的植物线粒体内蛋白是由核编码的，因此核编码蛋白对于线粒体结构维持和功能发挥起着不可忽视的作用。绝大多数植物核编码蛋白在运至线粒体前都是以前体蛋白的形式在细胞质中合成的,其N末端含有一个可被剪切的前序列.就目前已知的前序列结构,它们都含有丰富的带正电荷的碱性氨基酸,尤其是精氨酸更占到15%,这些特性对于前序列进入带负电荷的线粒体基质具有重要作用.已有的研究表明植物

10、前序列长度从拟南芥交替氧化酶的13个氨基酸至甘氨酸脱羧酶亚基的85个氨基酸不等。但具有引导功能的前序列所需的最低长度目前仍不清楚。有趣的是，已经知道前序列的长度有一个上限，最长的前序列含有85个氨基酸，而大部分前序列长度在20-60个氨基酸之间。这可能是由于剪切前序列的线粒体加工肽酶(mitochondrial processing peptidase , MPP)只能剪切相对分子质量小于7000的多肽，而且只识别其二级结构而不是氨基酸序列。而这些前序列在转运过程中或者转运过程后都要被蛋白酶剪切去除。几百种线粒体前体蛋白的前序列是由线粒体加工肽酶(MPP)一步催化反应去除的。但在植物中，一些前

11、体蛋白的剪切需要两步才能完成。首先由MPP加工成中等大小的产物，然后由位于基质中的线粒体中间肽酶（mitochondrial intermediate peptidase, MIP）或者内膜肽酶（inner membrane peptidase , IMP）催化产生成熟的蛋白。在植物中研究最为广泛的肽酶就是MPP，是否还存在其它肽酶尚不知晓。目前已经从菠菜、小麦等植物中分离出了MPP，金属螯合剂EDTA完全抑制MPP对前体蛋白的加工，因此MPP是一种金属内切多肽酶。MPP是包含a-MPP和p-MPP两个亚基的异二聚体，其自身也是由核编码后在细胞质中合成的，通过转运系统进入线粒体，其前体蛋白的加

12、工由线粒体中已有的MPP来完成。由此看来,前序列对于线粒体蛋白的识别和跨膜运转起着关键作用.但又有实验证明前序列不足以牵引蛋白进入线粒体。去除马铃薯腺嘌呤核苷酸转运蛋白(ADP/ATP translocator，ANT)前序列不会影响成熟蛋白的运输，说明该蛋白的引导信息位于成熟蛋白中。尽管ANT前序列在体内不具有导向功能，但将其与玉米成熟蛋白N末端20个氨基酸连接，能体外牵引二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase ，DHFR)进入线粒体，这表明成熟蛋白N末端对蛋白运输相当重要，也说明ANT的前序列并不是没有导向功能的。 由于运入质体的蛋白质也具有前体形式,因此关于前体蛋

13、白在植物线粒体和质体间的分选也争论以久.1986年Hurt报道了衣藻属叶绿体核酮糖二磷酸羧化-加氧酶小亚基的转运肽可将二氢叶酸还原酶(DHFR)牵引至酵母线粒体。而进一步的研究表明向线粒体转运的前体蛋白具有特异性，同样有实验证明向叶绿体和质体转运的前体蛋白也具有特异性。这就引出了如何在线粒体和质体之间准确分选定位的问题。另一个明显的错误定向是衣藻属PsaF叶绿体蛋白可转运到分离的菠菜线粒体中去。如果PsaF前序列被剪切或缺失，其蛋白的转运效率几乎不变，这表明成熟蛋白可能具有引导活性，意味着在细胞质中还存在控制分选的其他机制。在豌豆叶肉细胞的细胞质中存在一种蛋白激酶，这种激酶在ATP存在的条件下

14、将前体蛋白磷酸化使之向叶绿体转运，如果该激酶不磷酸化则使前体蛋白向线粒体转运。蛋白转运实验也证明了前体蛋白的磷酸化促使其与叶绿体结合，说明一种蛋白激酶介入了前体蛋白向叶绿体的转运及在线粒体和叶绿体之间的分选。豌豆的谷胱甘肽还原酶前体蛋白既可转运至豌豆线粒体，又可转运至烟草叶绿体。表明前序列(转运肽)负责前体蛋白的定位，就如同移去这种前序列而代之以特异性的线粒体或叶绿体前序列一样。那么是否这种前序列代表一种引导信息，牵引蛋白同时进入两种细胞器还有待研究。信号序列定位转运装置信号序列位置位于N端，富含带正电荷的和疏水的氨基酸，形成两性螺旋，完成转运后被切除。基质TOMTIM23不被切除，含疏水性的

15、停止转移序列，被安插到外膜。外膜TOM被切除，含疏水性的停止转移序列，被安插到内膜。内膜TOMTIM23含两个信号序列，首先转运到基质，第一个信号序列被切除，第二个信号序列引导蛋白进入内膜或膜间隙。内膜膜间隙TOMTIM23结构类似于N端信号序列，但位于蛋白质内部。内膜TOMTIM23为线粒体代谢物的转运蛋白，如腺苷转位酶，具有多个内部信号序列和停止转移序列，形成多次跨膜蛋白。内膜TOMTIM22表1 线粒体蛋白分选信号* 这个跨膜过程有以下特点:(1)前体蛋白过膜时,前体肽被水解,释放成熟蛋白;(2)该过程是一个耗能过程;(3)蛋白质通过膜运转时,首先由外膜上的TOM受体复合蛋白识别与HSP

16、70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽,通过TOM和TIM组成的膜通道进入线粒体内腔.且蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒体HSP70引发的ATP水解和膜电位差.而TOM复合体是一种转位因子,它由两部分组成,即受体和蛋白质通过的孔道.它负责通过外膜，进入膜间隙，在酵母中TOM70负责转运内部具有信号序列的蛋白，TOM20负责转运N端具有信号序列的蛋白，这两种蛋白的功能都相当于内质网上的SPR受体，在人类线粒体中hTom34的功能与TOM70相当。TOM复合体的通道被称为GIP（general import pore），就相当于内质网上的SEC61复合体，主要由Tom40构成， 还包括Tom22，

17、 Tom7， Tom6和Tom5；TIM复合体，其中TIM23负责将蛋白质转运到基质，也可将某些蛋白质安插在内膜；TIM22负责将线粒体的代谢物运输蛋白，如ADPATP和磷酸的转运蛋白插入内膜.图2 蛋白质进入内膜和膜间隙 引自Molecular Biology of the Cell. 4th ed. 2002，（A. 进入内膜和膜间隙的前体蛋白具有两个信号序列，经TOMTIM23进入基质后，第二个信号序列使蛋白通过OXA复合体被安插到内膜上；B. 进入内膜和膜间隙的前体蛋白信号序列后具有停止转移序列，被TIM23安插在膜上，C. 通过途径A、B插入内膜的蛋白，被位于内膜的蛋白酶加工，成为膜

18、间隙的可溶性蛋白，D. 线粒体代谢物的转运器为多次跨膜蛋白，被TIM22安插到内膜中）此外,该过程中分子伴侣也起到了重要的作用.同上,分子伴侣可稳定末折叠或部分折叠的多肽，防止不适当的多肽链内或链间的相互作用，参与前体蛋白的转运、折叠和组装过程。有些分子伴侣也可与天然构象的蛋白相互作用以促使寡聚态蛋白发生结构重排。前体蛋白不能以折叠构象进行跨膜运动，因为紧密折叠的结构域在某些情况下会影响蛋白转运的效率。因此转运时前体蛋白必须在线粒体外被打开，或者保持松弛状态且防止松弛状态的蛋白聚集。研究表明一些胞质分子伴侣，如Hsp70与新合成的胞质前体相互作用，抑制前体不正常接触、不正常折叠。在体外情况下去

19、除胞质HSp70将导致线粒体F1-ATP酶p亚基前体在胞质中聚集。除此之外，Hsp70还具有引导前体蛋白穿过线粒体膜进入基质，促进不稳定蛋白降解等功能网。而HSp60、HSp10、Cpr3家族则仅参与蛋白在基质中的折叠。但是关于分子伴侣控制蛋白折叠的机理还没有完全清楚。 有实验证明HSp70用一种类似棘轮的分子机制促进前体蛋白转运，当前体蛋白的前序列通过蛋白质通道(proteinaceous channel)而进入线粒体内腔时，基质中的一分子HSp70立即与前体蛋白上适当片段结合，防止其后退滑回细胞质;随着前体蛋白向线粒体内腔的进一步伸入，有更多的Hsp70与之结合，进而促进整个前体蛋白进入线

20、粒体。HSp70与前体蛋白的结合时功能的发挥则需要ATP，在玉米胚乳细胞质中的HSp70就发现有低水平的ATPae活性。除ATP外，HSp70还可催化UTP、GTP、CTP和ITP的水解。结构上所有HSp70家族蛋白如DnaK、DnaJ和GrpE都由一个高度保守的44X103大小的N末端ATP酶功能域和一个25X103大小的C末端区构成，C末端区又分为一个保守的l5X1底物结合区和一个10X103的C末端区(图3)。ATP在结合于HSp70的N末端之后，改变HSp70与底物的亲和力，进而实现HSp70与底物结合并以环状引导前体蛋白进入线粒体. 图3 Dnak 结构图 (图上文字为蛋白功能区，图

21、下数字为各功能区氨基酸起止位置)2.叶绿体的蛋白质跨膜运转叶绿体多肽是一种在胞质中的游离核糖体上合成后脱离核糖体并折叠成具有三级结构的蛋白质分子,其多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点.其定位信号肽一般有两部分,以决定其是否进入叶绿体基质和决定其能否进入类囊体.叶绿体蛋白质运输有以下特点:(1)活性水解酶位于叶绿体基质内,这是鉴别翻译后运转机制的指标之一,因为翻译-运转同步机制的活性蛋白酶位于运转膜上;(2)叶绿体膜能够特异地与叶绿体前体蛋白结合;(3)叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质的种类不同而表现明显的差异.其N端的基质定位信号保证蛋白质能在叶绿体被膜的双层膜

22、结合的部位穿过叶绿体被膜，叶绿体双层膜的连接是通过定位在外膜和内膜上的转运蛋白质组分（TOC和TIC）的相互作用实现的，TIC含有4种蛋白：Tic20, Tic22, Tic110, 和Tic55。Tic20形成TIC在内膜上的跨膜孔道，而位于叶绿体膜间隙的Tic22再转运蛋白质的过程中维持TIC和TOC的连接，Tic110在stroma一面形成一个大的连接着分子伴侣ClpC(Hsp100家族的成员)的亲水区域，可以帮助蛋白质进入叶绿体。而亚叶绿体水平的蛋白质定位是由进一步的信号肽介导的，在类囊体膜和叶绿体被膜上的整合蛋白质中，蛋白质肽链中间的一些疏水残基起到信号肽的作用。这些信号可以延迟蛋白

23、质的转运使蛋白质停留在膜上也可以使已经转运了的蛋白质返回到膜上。以下介绍叶绿体上转运蛋白的亚基的定位情况：叶绿体被膜的外膜蛋白（OEP7，OEP14，OEP24，Toc34和Com70）不含有可剪切的转位肽，它们插入到膜中或者连接在膜上（Com70），这个过程不需要提供能量，也不需要其他转运蛋白的参与。而Toc86和Toc75含有可剪切的转位肽。但是在Toc86的N端有一段不寻常的带负电荷的肽链，这导致它不能通过通常的通用路径被转运，因此在跨膜的时候它不会和核酮糖-1,5-二磷酸羟化/加氧酶的亚基发生竞争。Toc75（OEP75）是通过通用途径转运的，不过由于它在转位肽后面有一段疏水序列，To

24、c定位在膜上而不是进入叶绿体中。而要定位于叶绿体膜上的蛋白质前体有一个基质定位的的N端序列，在磷酸盐转位子和Tic110中就有这样的疏水跨膜域，保证了这些蛋白质插入到膜内。另外,在实验中，结合在叶绿体外膜上的蛋白质很容易被蛋白酶水解，这暗示它们处于个伸展的状态。因为蛋白质的这种伸展的转运方式，这个过程涉及一些分子伴侣，包括外膜上的Com70（和TOX结合），膜间隙中的Hsp70和内膜基质面的ClpC。ClpC被认为是通过水解ATP来给蛋白质提供一个向叶绿体内转运的动力。图4 叶绿体的蛋白质定向转运 引自Molecular Biology of the Cell. 4th ed. 20023.向

25、细胞核的蛋白质运输在细胞质中合成的蛋白质一般通过核膜上的核孔复合物进入细胞核.核孔复合物是一个分子量高达125MDa的巨大多聚体，含有100多条肽链和孔蛋白。其结构仿佛一个篮子，由两个蛋白质环和连接环的纤丝组成，核孔复合物在关闭时孔径为10nm，而开放时达40nm，这种改变是由纤丝中孔蛋白的构象改变引起的。不过即使在关闭时，核孔也大到可以允许40-60KDa的蛋白质被动的通过，只不过这种穿透非常缓慢，甚至需要数个小时才能完成.在绝大多数多细胞真核生物中,当细胞发生分裂时,核膜被破坏,等到细胞分裂完成以后,核膜重新构建,分散在细胞内的核蛋白必须被重新运入核内,因此,为了核蛋白的重复定位,这些蛋白

26、中的信号肽,即核定位序列(NLS)一般都不被切除.且NLS可位于核蛋白的任何部位.蛋白质向核内运输过程需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子,包括核运转因子和一个相对分子质量较低的GTP酶. 而相对的核孔复合物的组成对这个过程的调节倒没有多大意义。三结束语目前在植物核编码蛋白转运方面报道了许多研究成果，从已有的成果可以看出，与非植物材料相比植物核编码蛋白的转运存在许多独特之处，但是与非植物材料的研究成果相比还显得很不深入，许多问题仍需要继续探索。植物细胞由于存在两种内共生的细胞器 线粒体和质体(或叶绿体)，使得核编码蛋白的转运更为复杂。在这20余年的研究过程中，植物蛋白转运过程中的许多独特之处

27、已经发现。今后随着技术的发展以及基因组测序计划的完成，植物蛋白转运的研究必将得到长足的发展。参考文献：1EISharova Protein transport in plant cell Russial journal of plant physiology Vol 49. No2.2002 pp 2552682. Politz, J.C., Yarovoi, S., Kilroy, S.M., Gowda, K., Zwieb, C., and Pederson, T., Signal Recognition Particle Components in the Nucleolus, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 2000, vol. 97, pp. 5560.3. 李晨东 陈喜文 陈德富 植物核编码线粒体蛋白转运的研究进展 生物技术通讯 2003.4.Lorenzo Fr