接触系统生物学意义的再认识

1、    接触系统生物学意义的再认识        摘要目前，凝血学说发生了概念性改变，认为体内凝血过程分为两个阶段，组织因子途径负责凝血过程的启动，以因子(F)为起点的内在途径负责凝血过程的放大，而接触系统并不参与体内凝血过程。已有资料表明，接触系统是一个重要的血管生物学调制系统。它的主要作用包括调整血管紧张度、抑制血小板活化、促进纤溶、抑制粘附以及促进炎症等。它的改变与败血症、血栓性疾病等病变过程密切相关。关键词接触系统;组织因子途径;高分子量激肽原;前激肽释放酶;因子学科

2、分类号R331.1;R554Revision ofthe Biological Significance of the Contact SystemLIU Fa-Yi,HE Shi-Lin(Department of Physiology,Hunan Medical University,Changsha 410078)AbstractCurrent concept of blood coagulation is divided into two stages:an “initiation” stage which is handled by tissue factor pathway,and

3、 an “augmentation” stage handled by intrinsic pathway beginning in factor .Recent studies have demonstrated that the contact system is a modulator for vascular biology with vascular tone regulation,anticoagulant,profibrinolytic,antiadhesive and proinflammatory functions.Changes of contact system are

4、 associated with sepsis,thrombosis,etc.Key wordsContact system;Tissue factor pathway;High molecular weight kininogen;Prekallikrein;Factor 一、问题提出接触系统(contact system)是由高分子量激肽原(HK)、前激肽释放酶(PK)和因子( F)组成。在体外条件下，该系统必需与外源性带负电荷表面接触才能激活，故称接触激活。若将玻璃试管的表面负电荷予以中和或覆盖，则引起凝血时间显著延长。并且在接触系统F、PK和HK三者中的任何一个蛋白缺乏(缺陷)，均可使

5、激活的部分凝血活酶时间(APTT)和全血凝固时间(CT)明显延长。接触激活的最终产物是激活的因子，即因子a(Fa)的形成。因此经典的瀑布学说认为接触激活F是内在凝血途径的启动环节。然而临床与实验材料表明，接触系统三个蛋白缺乏(缺陷)在体内并不引起出血表现；相反，这三个蛋白纯合子缺乏患者存在血栓倾向。所以现在普遍认为接触系统并不参与生理性止血的凝血过程。不仅如此，在病理条件下弥漫性血管内凝血(DIC)的发生也与该系统没有明显相关。对于体内凝血过程，目前盛行的是两阶段学说13，即启动阶段和放大阶段。启动阶段是通过组织因子(tissue factor,TF)途径(外在途径)实现的，当血管受损时，暴露

6、的TF即因子（F）与血浆中的因子(F)相互作用，使后者激活成激活的因子(activated factor ，Fa)，并形成Fa/TF复合物。此复合物激活因子(F)和因子(F)成Fa和Fa，导致凝血酶的生成，但由于血小板催化表面尚未形成，因子(F)和因子(F)没有活化，不可能生成足量的凝血酶；特别是组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)对Fa与Fa/TF具有灭活作用，故在启动阶段只可能形成少量凝血酶。然后是放大阶段，即启动阶段生成的少量凝血酶既活化血小板，形成磷脂催化表面；又活化F和F，使之发挥凝血辅因子的活性；同时少量凝血酶通过激活F，从

7、而通过内在途径促使足量凝血酶生成与纤维蛋白的形成。虽然接触系统在生理止血过程中的意义趋向于否定，但这并不意味着该系统在体内没有重要意义。那么接触系统究竟有何生物学意义呢？越来越多的事实表明，接触系统对血管生物学特性具有重要调制作用。接触系统蛋白在体内主要与血管内皮细胞、血小板、中性粒细胞和单核细胞发生反应，在体内非但没有激活接触系统的带负电荷表面，而且实际上它们的活化也不需要带负电荷表面，而是装配在这些细胞的细胞膜上。过去所谓由带负电荷表面接触激活，实际上是将体外试验结论直接推论到体内的结果，这是对接触系统的一种“历史误会”，对于生理科学工作者来说，这也是应当引以为戒的一个教训。从已有资料来看

8、，接触系统三个蛋白主要与血压调节、抗血小板活化、促纤溶、抗粘附与促炎症等功能有关。二、接触系统蛋白的装配与激活4，5在体内接触系统三个蛋白发挥生物效应有赖于它们装配在细胞表面。F的重链中有与表面结合部位。但在接触系统中，HK是表面装配的关键蛋白。HK由重链、含缓激肽(BK)肽段和轻链三部分组成。重链包括第13功能域，BK组成部分居于第4功能域，轻链包括第5、6二个功能域。第1功能域存在一个亲和力较低的钙结合部位，并对心房钠利尿肽具有抑制活性。第2功能域有一个半胱氨酸蛋白酶抑制部位，主要抑制钙赖酶(calpain)。第3功能域也有一个半胱氨酸蛋白酶抑制部位，它与第2功能域均能有效地抑制木瓜蛋白酶

9、(papain)与组织蛋白酶(cathepsin)L。第3功能域还含有一个重要的细胞结合部位。第4功能域的主体部分是BK，其N末端有-凝血酶抑制活性，其C末端有一细胞结合部位。第5功能域是HK与细胞结合的主要部位，也含有与人工表面结合部位。第6功能域是PK与F的结合部位。在HK与各种细胞结合过程中，Zn2+是绝对必需的。当HK结合于血小板、粒细胞或内皮细胞时，其亲和力介于752nmol/L。由于血浆中HK浓度是670nmol/L，故血管内所有激肽原结合部位可能是饱和的。不同细胞表面激肽原结合位点的数量是不同的，血小板约1000位点细胞，粒细胞约50 000位点细胞，血管内皮细胞约10 000

10、000位点细胞。由此可见，HK与血管内皮细胞结合可能具有十分重要的生物学意义。细胞膜的HK结合位点可能是一类多蛋白复合物。对于HK与粒细胞的结合以及HK与经 ADP活化血小板的结合，纤维蛋白原是一个非竞争性抑制物。同样，HK对纤维蛋白原与粒细胞和活化血小板的结合也有抑制作用。抗体抑制实验表明，CD11b/CD18或与这一整合素连接在一起的复合蛋白可能是粒细胞的HK结合部位。利用亲和层析方法发现血管内皮细胞表面的 C1q受体(C1qR)能与HK 的第5功能域结合。F能阻断HK与C1qR相结合的位点。新近实验表明，HK可与血管内皮细胞表面的尿激酶受体结合，进一步工作提示结合部位在尿激酶受体的第2

11、和第3功能域之内6。也有报道血管内皮细胞膜的细胞骨架蛋白(cytokeratin)能对HK 发生选择性结合，这种结合是Zn2+依赖性的。进一步实验证明，HK的第3和第5功能域都存在与细胞骨架蛋白结合的部位。HK结合于内皮细胞与血小板具有重要意义。首先，这种结合可以避免血浆中蛋白酶特别是激肽释放酶(Ka)对HK的水解。其次，结合在细胞膜表面的HK第6功能域可以作为PK与F的受体。尽管体外试验表明，在PK与细胞膜表面HK结合后，PK可以通过Fa依赖性或非Fa依赖性机制而被激活。然而迄今为止，在体内并未发现诱导F自我激活的生理性带负电荷表面。在体内的PK激活主要是通过非Fa依赖性机制。晚近实验证明，

12、细胞膜或基质中的一种巯蛋白酶(thiolprotease)能够将PK激活成为Ka7。与Fa相似，该酶也使PK的精371异亮372肽键裂开。由此转变而成的Ka的重链具有与HK结合部位，轻链含丝氨酸蛋白酶活性中心(由组415、天冬464与丝559组成)。当PK与装配在细胞膜表面HK结合后，巯蛋白酶活性增高，促使Ka生成。实验还表明在细胞表面的PK激活的速率随着HK浓度增大而增快。不仅如此，与HK呈结合状态的Ka可以避免C1抑制物和2-巨球蛋白对它的灭活。Ka 一旦形成，它即酶解HK的赖362精363和精371丝372二个肽键，从而释放一个九肽(RPPGFSPFR)，即缓激肽(BK)。释出BK后的H

13、K称为HKa。当HK变为HKa后，PK被激活的速率也随之减慢。另一方面，由于BK能够上调血管内皮细胞膜HK结合位点的表达，故随着BK增加，细胞膜HK结合位点增多，从而使较多HK免于Ka的裂解，BK生成随之减少。关于F的激活，在Zn2+存在条件下，F与带负电荷表面接触导致构象改变，这种活化称为自身激活或固相激活。Ka通过酶解方式活化F，称为液相激活。在体内并无生理带负电荷表面，因此F的激活通常发生在Ka形成之后8。Ka对F的作用首先是裂开精353缬354肽键，使单链F激活成为双链的Fa(又称Fa)。Fa分子量约80kD，它的重链与轻链之间通过一个双硫键相连。重链存在表面结合部位，轻链存在丝氨酸蛋

14、白酶活性中心(由天冬442、组393、丝554组成)，故既有与带负电荷表面结合的能力，又能有效地激活F，但激活PK与补体成分C1能力相对较弱。随着Ka继续作用于Fa，将精334天冬335与精343赖344两处肽键裂开,释出一个长的多肽(原重链的异亮1精334)和一个短肽(原重链的344精353),由此得到的保留催化中心的多肽称为Fa(又称Ff)。Fa仍具有PK与补体成分C1的能力，但丧失了与表面结合的特性。三、接触系统对血管的调制作用接触系统具有多方面功能，但集中到一点就是对血管发挥调制作用。（一)调节血管紧张度实验发现，Ka过量表达的转基因动物表现明显低血压，Ka结合蛋白(Kallikrei

15、n-binding protein，又称Kallistatin)可使这种动物血压正常化。 对自发性高血压大鼠进行组织Ka转基因治疗，可以有效地降低血压；同样，这一降压效应也可被Ka结合蛋白所取消。Ka本身并无降压作用。Ka这一作用是通过它作用于激肽原，生成BK而实现的，因为BK能强烈刺激血管内皮细胞合成PGI2和NO，这两种物质均具有很强的舒血管作用。 以带负电荷的硫酸右旋糖甙激活接触系统，可以使动物产生低血压，B2受体阻滞剂(HOE140)能阻断低血压反应，但B1受体阻滞剂并无此作用。由此可知BK降压作用是通过B2受体介导的。一般认为由血浆中HK释放的BK与全身血压调节有关，由组织低分子量激

16、肽原(LK)释放的BK主要与局部血流量调节有关。对正处于发育阶段的大鼠较长期给予B2受体阻滞剂，结果这些动物血压较高，心率较快，体重较重。因此BK可能是心血管活动的一个经常性调节因素。BK的血管生物学作用是相当广泛的。除上述调节血压作用外，还可通过PGI2与NO释放抑制血小板活化，通过组织型纤溶酶原激活剂(tPA)释放促进纤溶，通过NO-cGMP途径抑制血管平滑肌细胞增殖。 因此在血管内皮完整条件下，BK有利于防止血栓形成与动脉粥样硬化。BK在体内的半存期仅15秒，它主要被血管紧张素转化酶(ACE，又称激肽酶)灭活，故在BK 生成减少或灭活增多的情况下，使用ACE抑制剂，通过减少BK灭活，可以

17、有利于保护心血管。 然而也应看到问题的另一方面，在血管内皮完整性受到破坏时，BK直接作用血管平滑肌细胞，通过蛋白激酶C(PKC)和丝裂原激活蛋白酶(MAPK)途径可导致血管平滑肌细胞增殖，这虽有利于血管壁修复，但也是促进动脉粥样硬化的一个因素。因此，对血管内皮广泛严重受损患者使用ACE 抑制剂应持慎重态度。(二)抑制凝血酶对血小板的活化效应这一作用的机制涉及几个环节。首先，HK抑制钙赖酶。当-凝血酶激活血小板时，胞质与/或膜内的钙赖酶转位至活化的血小板表面。外露的钙赖酶随即水解血小板膜上活化的膜蛋白Ib(GPb)和ADP结合蛋白。GPb的水解与血小板的凝血酶受体活化有关。ADP结合蛋白的水解与

18、GPb/a活化有关，活化GPb/a 就是血小板膜形成纤维蛋白原受体的过程，这是血小板聚集发生的关键环节。HK通过第2功能域抑制钙赖酶，可以抑制凝血酶诱导的血小板聚集。其次，HK抑制凝血酶与其受体结合9。已知血小板膜蛋白Ib、因子和因子的复合物(GPb-)与凝血酶受体有关。凝血酶作用于血小板的第一步是它与GPb结合。HK通过第3功能域抑制凝血酶与GPb结合，从而抑制凝血酶对血小板的活化作用。此外，HK 抑制凝血酶受体的活化。在凝血酶与GPb结合后，凝血酶随即水解凝血酶受体精氨酸41后的肽键，从而引起受体变构，然后通过G蛋白启动磷酯酶C-三磷酸肌醇(PLC-IP3)途径和抑制腺苷酸环化酶-cAMP

19、(AC-cAMP)途径，使血小板活化。实验证明HK第4功能域中的RPPGF结构对凝血酶酰解它本身的受体具有抑制作用，因而可以抑制凝血酶对血小板的活化10。实际上，RPPGF五肽是BK前5个氨基酸组成的，在体内其即为激肽酶水解BK的碎片。正常血浆中含有微量的RPPGF，故其可能是一种生理性抗血小板活化物质。(三)促进纤溶接触系统参与体内纤溶过程的机制包括：（1）Ka与Fa均可直接激活纤溶酶原，但其作用远弱于tPA与尿激酶型PA(uPA)；（2）HK与内皮细胞尿激酶受体结合，通过促进Ka形成，而后Ka使单链uPA(scuPA)转变成为双链uPA(tcuPA)，后者促进纤溶酶原激活的活性远较前者高；

20、（3）BK刺激血管内皮细胞分泌tPA11，tPA促使纤溶酶原活化为纤溶酶。新近发现使用抗F的单克隆抗体可使纤溶活性明显升高，提示F具有抑制纤溶的作用12，但其机制并未阐明。一般认为这可能与F活化，通过内在途径使凝血酶大量形成，在促使纤维蛋白形成的同时，凝血酶与内皮细胞凝血酶调制素(TM)结合，既使蛋白C 活化，又使凝血酶活化纤溶抑制物(TAFI)得以激活的缘故。(四)抑制粘附5HK作为抗粘附蛋白，其主要依据包括：（1）不含 BK 的高分子量激肽原(HKa)能竞争性抑制其它粘附蛋白与带负电荷表面结合；（2）HKa也能竞争性抑制其它粘附蛋白与细胞表面结合；（3）无论附于表面或存在溶液中的HK均可阻

21、止细胞与被蛋白覆盖的表面结合。在人血浆与带负电荷表面接触后，可以发现纤维蛋白原很快结合于表面上，但经过若干分钟后在这些表面再也测不到纤维蛋白原。实验表明这是由于接触激活促使HKa形成，进而在表面由HKa取代了纤维蛋白原所致。也有报道HK与/或HKa 还可取代中性粒细胞与血小板表面的纤维蛋白原。新近观察到HKa不仅抑制血小板和单核细胞与细胞外基质蛋白的结合，而且抑制血管内皮细胞在覆盖了纤维蛋白原与外连蛋白(VN)表面的扩展。总之，在生理条件下接触系统在维持血液流体性和血管通畅性过程中起着重要作用。应当指出：在病理条件下，接触系统活化具有促进炎症发展的作用。其机制是复杂的。实验表明，Ka与Fa是强

22、有力的趋化物质，能引起中性粒细胞释放活性氧和弹性蛋白酶。 有人发现Fa能刺激单核细胞表达白细胞介素-1和白细胞介素-6。然而，在接触系统产物中促炎作用较强的还是BK，因为BK能使血管通透性明显增高。四、接触系统与疾病(一)遗传性血管性水肿5接触系统的主要血浆蛋白酶抑制物是C1抑制物与2-巨球蛋白，其中C1抑制物负责90的Fa与Ff和50的Ka的灭活。遗传性血管性水肿是由于C1抑制物先天性缺陷，从而造成BK生成过量所致。(二)败血症临床资料表明，革兰氏阴性细菌感染所致败血症(尤其是伴有休克的患者) 接触系统蛋白降低，相应的酶-抑制物复合物，如Ka-C1 Inh，Ka-a2M增高，并且这些改变与平

23、均动脉压改变显著相关。实验证明，事先给予狒狒抗F的单克隆抗体，以阻断接触激活，然后由静脉注入大肠杆菌，这些动物并不发生非可逆性低血压，但仍然发生DIC13。 新近实验表明，若事先给予激肽释放酶特异性抑制物(PRSI)，动物在接受内毒素注入后发生DIC，但可防止“成人呼吸窘迫综合征”的发生；若事先给予组织因子途径阻断剂(DEGR-a) 则可防止DIC发生，但对“成人呼吸窘迫综合征”的发生并无影响14。由此可见，败血症时接触系统活化主要涉及休克和全身性炎症反应综合征的发生，而DIC 的发生主要与组织因子途径启动有关。本室观察到内毒素休克时血中TF大增，TFPI/TF比值显著降低15。晚近资料表明，

24、大肠杆菌与伤寒杆菌的某些菌株存在纤维状表面蛋白(fibrous surface proteins，简称Curli)。Curli除可与细胞外基质蛋白(层素、纤联素等)相互反应外，还能与接触系统蛋白(F、PK、HK、F)和纤维蛋白原结合，但对其它凝血因子与抗凝蛋白并无结合能力。体外试验发现纯化的F与这些菌株结合后，随之自动激活成为a。将F、PK和HK 与这些细菌混合，不仅引起F和PK活化与BK产生，而且导致a形成。若将这些细菌加入人血浆，BK将增加100倍以上，并产生纤维蛋白缺陷的凝块。由静脉注入这些细菌，引起血浆中BK显著升高与纤维蛋白原耗竭，并伴随血压降低与凝血障碍。由此可见，革兰氏阴性杆菌纤

25、维表面蛋白与接触系统蛋白相互作用，在全身炎症反应综合征和败血症休克的发展中起着重要作用16，17。(三)心肺旁路在体外循环中，肝素化血液与人工表面广泛接触，引起接触系统活化。 由于纤溶系统与补体系统活化，因此损伤局部常有渗血现象。抑肽酶不仅抑制Ka和纤溶酶，而且抑制中性粒细胞和血小板活化18，现已广泛用于体外循环患者，并已收到良好的止血效果。本室观察到抑肽酶通过抑制Ka，可以与肝素抗凝发生协同作用，使激活凝血时间(ACT)与APTT大为延长。在此条件下，若仍以ACT或APTT作为判断肝素用量的指标，必然超过血中肝素实际浓度，所以，此时应采用全血或血浆凝血酶原时间作为监测肝素的指标19。（四)非

26、感染性关节炎与小肠结肠炎5，20临床与实验资料表明在这些非感染性炎症的发病学中，Ka-BK系统占有重要地位。无疑，对于这些患者给予Ka抑制剂或B2受体阻滞剂可能是有益的。（五)血栓性疾病5由于接触系统抑制凝血酶诱导血小板活化和促进纤溶以及抗粘附等作用，故在生理情况下该系统具有抗血栓形成的作用。随着F先天缺陷患者与HK先天缺陷患者均死于血栓性肺梗塞，其后陆续有人报道F、PK与HK缺陷患者出现血栓倾向。一般认为接触系统蛋白缺陷导致血栓形成，主要是由于纤溶系统受到抑制所致。刘发益(湖南医科大学生理学教研室，长沙 410078)贺石林(湖南医科大学生理学教研室，长沙 410078)参考文献1，Davi

27、e EW.Biochemical and molecular aspects of the coagulation cascade.Thromb Haemost,1995,7416.2，Camerer E,Kolsto AB,Prydy H.Cell biology of tissue factor,the principal initiator of blood coagulation.Thromb Res,1996,81141.4，Schmaier AH.Contact activation:A revision.Thromb Haemost,1997,78101107.5，Colman

28、RW,Schmaier AH.Contact system:A vascular biology modulator with anti-coagulant ,profibrinolytic,antiadhesive,and proinflammatory attributes.Blood,1997,9038193843.6，Colman RW,Pixley RA,Najamunnisa S,et al.Binding of high molecular weight kininogen to human endothelial cells is mediated via a site wit

29、hin domains 2 and 3 of the urokinase receptor.J Clin Invest,1997,10014811487.7，Motta G,Rojkaer R,Hasan AAK,et al.Hight molecular weight kininogen regulates prekallikrein assembly and activation on endothelial cells:A novel mechanism for contact activation.Blood,1998,91516528.8，Rojkaer R,Hasan AAK,Mo

30、tta G,et al.Factor does not initiate prekallikrein activation on endothelial cells.Thromb Haemost,1998,807481.9，Bradford HN,Dela Cadena RA,Kunapuli SP,et al.Human kininogens regulate thrombin binding to platelets through the glycoprotein b- complex.Blood,1997,9015081515.10，Hasan AAK,Amenta S,Schmaie

31、r AH.Bradykinin and its metabolite,Arg-Pro-Pro-Gly-Phe,are selective inhibitors of -thrombin-induced platelet activation.Circulation,1996,94517528.11，Brown NJ,Nadeau JH,Vaughan DE.Selective stimulation of tissue-type plasminogen activator(t-PA) in vivo by infusion of bradykinin.Thromb Haemost,1997,7

32、7522525.12，Minnema MC,Friederich PW,Levi M,et al.Enhancement of rabbit jugular vein thrombolysis by neutralization of factor :In vivo evidence for a role of factor as an anti-fibrinolytic factor.J Clin Invest,1998,1011014.13，Pixley RA,Dela cadena R,Page JD，et al.The contact system contributes to hypotensio