发酵工程大试验(2012)

1、湖南大学生物学院湖南大学生物学院2012年年5月月一、发酵设备二、发酵方式三、发酵罐操作四、蒸汽发生器五、空气压缩机六、空罐灭菌（空消）七、实际装料灭菌（实消）八、发酵培养九、溶氧（DO）与转速的关联十、发酵罐工作组织流程十一、思考题目 录空气动力系统：空压机。提供罐压、氧气、气动阀 动力灭菌系统：蒸汽发生器温控系统发酵罐自带电加热自来水冷却蒸汽发生器：灭菌消毒时用冷水机：控温低于水温时用 发酵系统：发酵罐 一、 发酵设备 发酵罐冷水机及蒸汽发生器空压机空压机表压发酵方式固体发酵法：曲池、固体发酵罐半固体发酵法：发酵罐液体发酵法：发酵罐二、发酵方式三、 发酵罐操作1.发酵罐、蒸汽发生器、空气压

2、缩机均属压力容器。操作时须小心谨慎。尤以灭 菌（空消、实消）最危险。灭菌时须全程看守，不得离人。2.发酵、空消、实消前所有盖板螺丝，探头、补料口螺丝须全部拧紧。将发酵罐 、蒸汽发生器进水龙头打开。3.发酵前，先将空压机打开，待空压机压力达到0.6MPa时，开发酵罐电源。如果 灭菌，须将蒸汽发生器、空压机全部打开后，再接通发酵罐电源。4.发酵罐开机： 开电源开搅拌电机下位机登陆系统设计程序运行程序5.发酵罐关机： 退出运行程序关搅拌电机关电源关水龙头 发酵罐 、蒸汽发生器进水龙头 发酵罐电源、电机开关及下位机发酵罐的控制及使用：通过下位机进行发酵罐的控制及使用：通过下位机进行1、通过下位机“登陆

3、系统”。2、输入密码后，点击“确认”。操作员“100”，低级权限。3、发酵罐在准备发酵或者灭菌时都必须先点击“系统控制”的 “启动”。6.发酵时，上位机只能监控及输出数据，用下位机设置参数。两者关系，下位机优 先。7.发酵过程中，发酵罐过压时(0.15MPa) ，（1）将进气流量设定为0，若仍不能控制，则将空压机关闭。（2）取消DO-转速关联控制，晚上无人值班时须取消DO-转速关联控制。8.发酵过程中，罐压必须为正压（？），通常为0.02-0.05MPa。四、 蒸汽发生器1.蒸汽发生器在空消、实消、取样时使用。 蒸汽发生器为压力容器，须谨慎操作。灭菌（空消、实消）及取样时，必须全程看守，不得离

4、人。2.使用时，打开蒸汽发生器的进水龙头，关闭排污阀，打开蒸汽排出阀，打开发酵罐蒸汽进入总阀 。3.开蒸汽发生器电源开机 。会出现缺水报警声，水泵运转补水，达到预定水位时，停止报警，水泵停止补水。4.密切注意蒸汽发生器的水位变化，若出现故障不进水，水位下降至刻度线下时，应立即关机、关电源。5.蒸汽发生器加热时，暂时关闭蒸汽阀门，待压力到达工作压力时，缓开蒸汽阀门，正常使用蒸汽。6.使用完毕，关机、关电源。若长时间不用，则应关闭进水龙头，并待蒸汽发生器冷却后，将水箱中的水排空。7.蒸汽发生器通常在灭菌或取样前20-30min开始工作，蒸汽发生器的工作压力为0.4-0.7MPa。 蒸汽发生器五、

5、空气压缩机1.空气压缩机在空消、实消、发酵、取样过程中，均须打开。功效主要在于：保持罐压。提供氧气。为气动阀提供动力。吹干空气过滤器。2.空气压缩机出口处工作压力必须达到0.6MPa才能维持发酵罐的正常工作。3.空气压缩机在发酵、灭菌前打开，在放罐结束后才能关闭。4.发酵过程中，发酵罐过压时(0.15MPa)，若进气流量设定为0，仍不能控制罐压，则须将空压机关闭。 空气压缩机六、 空罐灭菌（空消）1.空消通常在实消（实际装料灭菌）前或在发酵结束清洗完发酵罐后进行。指对罐体、管道、阀门、过滤器等的灭菌消毒。2.空消前打开蒸汽发生器、空压机，将pH、DO电极拔出，用堵帽螺丝塞住并拧紧。其余盖板螺丝

6、、补料口螺丝须全部拧紧。发酵罐视镜窗口装上防护板。3.空消前须将夹套中的水排空（？），发酵罐装入约5L水（将温度电极探头淹过即可）。4.开启发酵罐电源，登陆系统，点击“启动”，进入灭菌控制灭菌参数设定。 空罐灭菌转速设定0rpm 搅拌停止温度设定0 灭菌稳定温度设定121 灭菌时间设定1030min，一般为20min 灭菌完成罐压设定为0.05MPa 灭菌完成后温度设定37 灭菌完成后流量设定30.0L/min 点击“开始”，即可自动根据灭菌参数来灭菌。5.空消时，当罐体温度达到70时，开启底阀、放料阀通蒸汽，对底阀、放料阀灭菌消毒。6.空罐灭菌全程须有人看管，如有报警，立即处置、报告。灭菌罐

7、压0.15MPa。7.空消结束后，按序关闭蒸汽发生器、发酵罐、空压机。七、 实际装料灭菌（实消）1.实消是指实际装料灭菌，通常在空消后进行。实消前要将夹套中的水排空。2.实消前，先将pH、DO电极用pH标准液及饱和亚硫酸钠溶液通过下位机的“pH电极校正”、“DO电极校正”界面，采用“两点自动校正法”校正，然后装入发酵罐，拧紧螺丝。3.从发酵罐顶部入料口装入预先配置好的发酵培养基营养盐溶液约5升，再倒入固形料（如麸皮、豆饼粉等），然后补充剩余水份。装料系数一般为0.7（20L罐，实际装料量为14L）。预留出灭菌冷凝水或蒸发水的量。若灭菌后产生冷凝水，灭菌前须少加水；若灭菌后蒸发了水，灭菌前须多加

8、水。4.调整好液位电极和消泡电极的位置并旋紧，灭菌完毕不得再调整液位电极和消泡电极的位置（？）。如果不用，则可拆下并用堵头封住。 本实验仅调整消泡电极的位置。5.打开空压机、蒸汽发生器，拧紧发酵罐的盖板螺丝、补料口螺丝。发酵罐视镜窗口装上防护板。所有罐体上的部件都必须保证是安装可靠的，以防泄漏和罐压升高时造成危害。 pH电极校正电极校正：两点自动校正法。通过下位机进入“pH电极校正”界面1、把pH电极放入6.86的标准缓冲溶液中，在“测量值1”处输入标准值6.86，等“当前电压”稳定后，点击 “第一点确认” ，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。2、把pH电极放入4.00（

9、酸性发酵）标准缓冲溶液中，在“测量值2”处输入标准值4.00，等“当前电压”稳定后，点击“第二点确认” ，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。3、点击“自动校正”，系统自动计算出零位和斜率。电极校正完成。DO电极校正电极校正：两点自动校正法。通过下位机进入“DO电极校正”界面1、把DO电极放入饱和亚硫酸钠溶液中 ，等“当前电压”稳定后，点击 “第一点确认” ，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。DO显示值在5%以下即可。2、把DO电极放入饱和湿度的空气中（用湿滤纸包住DO探头）。在“测量值2”处输入标准值98，等“当前电压”稳定后，点击“第二点确认” ，

10、系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。3、点击“自动校正”，系统自动计算出零位和斜率。电极校正完成。6.开启发酵罐电源，下位机登陆系统，点击“启动”，进入灭菌控制灭菌参数设定。 搅拌速度设定100rpm 搅拌停止温度设定90 灭菌稳定温度设定121 灭菌时间设定30min 灭菌完成罐压设定为0.05MPa 灭菌完成后温度设定37 灭菌完成后流量设定30.0L/min 点击“开始”，即可自动根据灭菌参数来进行实消。7.实消灭菌全程须有人看管，如有报警，立即处置、报告。灭菌罐压0.15MPa。8.实消罐温达到121 后，要对发酵罐机械密封，取样阀，底阀 通蒸汽灭菌，在灭菌搅拌停止

11、时用手动灭菌 。灭菌时，先开启蒸汽进气阀，再微开蒸汽出口阀，三者灭菌20min 。灭菌完成后，先关闭开蒸汽出口阀，再关闭蒸汽进气阀。实消时不允许蒸气通过底阀进入发酵罐（？）。9.实消时，罐温达到121 后，还要对空气过滤器、尾气过滤器灭菌，两者过滤器顶部压力表压要达到0.1MPa 。若压力达不到，可关小尾气手动阀。10.实消完成后，关闭蒸汽发生器。待罐温、罐压、转速等达到发酵参数设定值后，必须对pH电极进行在线校正，对DO电极进行100满度值校正（？）。11. pH电极、DO电极的在线校正通过下位机进入“pH电极校正”、“DO电极校正”的界面， pH电极在线校正：通过调零位，使pH显示值与标准

12、pH计测定值一致（需要取样30mL测定）。 DO电极的在线校正：通过调斜率，在正常发酵温度、罐压、转速、通气量状况下，使DO显示值达到100满度值。两者校正完毕后，按界面上的“返回”即可。pH电极校正DO电极校正八、 发酵培养1.实消完成后，当罐温达到30-35，罐压达到0.02-0.03MPa，搅拌转速为100rpm时，即可上罐接种。2.接种时，室内空气要保持相对静止，关掉空调及电风扇，将菌种及要补充的无菌水移近发酵罐。两小组的液体种须事先汇集到两个大三角瓶中（200mL2瓶）。3.在接种火圈环内压入燃烧酒精棉球，发酵罐顶部轴、螺丝等不锈钢处，用75的酒精棉球擦拭消毒，点燃酒精棉。4.戴好防

13、烫手套，打开接种盖，将装菌种的三角瓶瓶口在火焰上灼烧，按接种量迅速倒入液体菌种，补充无菌水至14L，盖上接种盖，并用火焰再次灼烧接种口。5.在下位机上，登陆系统，点击“启动”，进入“发酵控制”，按工艺要求，设定发酵温度、罐压、转速、通气量等后，点击“自动启动”开始发酵培养。也可按“标准启动”后，再设置运行参数。6.记录接种时间。从接种时计算，每隔1hr，用实验记录本记录罐温、搅拌速度、通气量、罐压、pH、DO、泡沫变化、发酵液粘稠度、发酵液颜色等数据。7.每隔12hr取样一次（通常为上午8：30，晚上8：30），取样量约30mL，取样前30min，打开蒸汽发生器，待蒸汽压力达到0.6-0.7M

14、Pa时，通过手动隔膜阀对取样口进行灭菌，灭菌时间20min，关闭蒸汽阀门。用火焰封住取样口，将灭过菌的取样瓶口置于火焰上灼烧，拔出瓶塞，同时，戴好手套，拧开取样阀，先放出30mL发酵液弃之，再接入30mL作为样品。取样后，关闭取样阀，打开蒸汽阀门，对取样阀再进行5-10min灭菌。关闭蒸汽发生器，对样品进行镜检，测定酶活。8.放罐：到达发酵时间后，须放罐。放罐通过底阀进行，放罐前30min，打开蒸汽发生器，通过底阀手动隔膜阀对底阀灭菌20min；适当提高转速及罐压，用不锈钢桶接住，旋松底阀开关，将发酵液放入不锈钢桶内。9.放罐完毕，关闭蒸汽发生器，停止搅拌，及时将发酵罐清洗干净，以防染菌污染。

15、10.发酵罐清洗完毕后，对发酵罐要实施空罐灭菌，对罐体、过滤器、管道、阀门等进行灭菌消毒。11.实验报告：根据所记录的数据，绘制pH、DO、生物量、酶活、残糖量对发酵时间的动态曲线图。九、 溶氧（DO）与转速的关联1.在“DO控制”界面，点击“高级”。2.在“DO高级控制”界面,将“转速DO关联”设为“ON”，”系数”设为5-50，取值越大关联度越小。再设“DO高级控制”旁边的“OFF”为“ON”，点击“返回”。 “DO控制”为“ON”。3.DO与转速相关联后，转速设定值不再起作用。50rpm转速700rpm4.在“转速控制”界面，点击“高级”。5.在“转速高级控制”界面，“转速设定值”与正常

16、所需转速相同，“转速DO关联”为“ON”， “转速高级控制”为“ON”， 按“返回”。 “转速控制”为“ON”。6.转速与DO关联后，转速设定值不再起作用。50rpm转速700rpm7.注意：当下位机不显示，需重启时，一定要将转速与DO关联取消，先采用100-200rpm转速待DO值上升后，再设定转速与DO关联。否则，会造成电机高速飞转损毁。8.考虑到泡沫过多易堵塞尾气过滤芯的情况，不建议将DO-转速进行关联。转速维持在250rpm左右。十、发酵罐工作组织流程1、罐体清洗：对罐体、搅拌桨、各管路清洗疏通。2、空罐消毒：空消兼保压试验。121，20min，罐压0.15MPa。3、实际装料灭菌（实

17、消）：实消前，将校正好的pH、DO电极装入发酵罐，灭菌后，需对pH、DO电极在线校正。此过程还需对机封轴、取样阀、放料阀、级空气过滤器、尾气过滤器灭菌。 121，30min（阀门、过滤器为20min），罐压0.15MPa。4、发酵培养：罐压维持0.02-0.03MPa。记录罐温、搅拌速度、通气量、罐压、pH、DO、泡沫变化、发酵液粘稠度、发酵液颜色等数据。每隔12hr取样一次。根据所记录的数据，绘制pH、DO、生物量、酶活、残糖量对发酵时间的动态曲线图。5、放罐及后续工艺处理阶段：放罐完毕，取下pH、DO电极，清洗干净后，装入电极保护液套中保存。发酵液进入后续处理工艺。6、罐体清洗：关闭蒸汽发生器、停止搅拌，及时将发酵罐、搅拌桨等清洗干净，防止微生物污染、扩散。7、空罐消毒：对发酵罐中残存微生物灭菌。此过程还需对机封轴、取样阀、放料阀、级空气过滤器、尾气过滤器灭菌。 1