生计生物工程实验教案

1、生 物 工 程 实 验（发酵工艺部分）生物工程教研室贾月梅目录实验一生物反应器操作技术- 2实验二酸奶制作-11实验三亚硫酸盐氧化法测定溶氧系数KLa值-12实验四酒精发酵培养基的制备-15实验五酒精发酵-16实验六酒精蒸馏及指标测定-18实验一生物反应器操作技术实验目的1.了解生物反应器的结构2.学会使用生物反应器(包括启动、灭菌、装料、取样、清洗、关机)反应器的操作方法1、基本操作技术1.1结构 发酵罐由罐体系统、恒温座、管阀系统及辅助设备组成.罐体系统 罐体系统包括：罐身、罐盖、密封件罐身：由玻璃及不锈钢组成罐盖布局 1.排气接口 2.温度电极插口 3.PH电极插口 4.空气接口 5.取

2、样管接口 6取样平衡口 7.接种口 8补料口 9备用口 10 传感器接口 11 泡沫电极接口 控温座罐阀系统 冷却水电磁阀、溢流水阀、排气排水阀、进蒸汽调节阀、气路调节阀、胶管、接头组成1.1. 4辅助设备 空气压缩机、蒸汽发生器等1.2安装发酵罐应安装在通风良好、空气清洁的房间。将罐体与控制电箱放在平整的桌面上，调节水平垂直度连接进水、排水、空气进气管，固定。将搅拌电机、PH电极、DO电极消泡、测温电极等与控制箱相连。安装好地线，保证良好的接地。1.3开机与关机开机顺序：先开电源总开关，再打开电脑控制系统电源开关关机顺序：先关电脑控制系统电源开关，再关断电源总开关。1.4装料、装料 将培养基

3、倒入发酵罐中，盖好罐盖。灭菌。2.参数设定与控制2.1电极的标定与维护PH电极的标定主菜单按F3进入标定， 按F1进入PH电极标定 画面如下按F1温度设为环境温度，电极插入中性缓冲溶液如PH6.86缓冲液中，按F2输入零点标定值6.86 Ctrl+F2PH零点标定开始，显示“确认？”后按Enter键，PH标定开始待PH显示值稳定后，按Enter键结束PH零点标定。然后擦净电极。插入酸性或碱性溶液中如PH=4.00按F3 输入斜率4.00Ctrl+F3PH斜率标定，同上。再标定零点，反复直至更换缓冲液时PH未经标定已达标准值（附近）即可。DO电极的标定按F2进入DO标定 画面如下将DO电极拔出，

4、浸没于饱和的亚硫酸钠溶液中， 按F2输入零点标定值1%Ctrl+F2 DO零点标定开始，显示“确认？”后按Enter键，DO标定开始待PH显示值稳定后，待电极显示值稳定后标零点（一般用1%）按Enter键结束零点标定。按F3 输入斜率100%Ctrl+F3DO斜率标定，显示“确认？”后按Enter键，DO标定开始（以空气为100%标定）待DO显示值稳定后，按Enter键结束斜率标定。再标定零点，反复重复上述步骤12次。加酸泵的标定（可以随时进行）先取一定液体，安装好酸管按F3进入加酸泵标定 画面如下按F1可以直接输入加酸速率（ml/m）， 按F2输入标定用标准容量100ml，将自动开关调为手动

5、位置，使泵运转，等到管内空气排出并已开始滴液，将出口的液体滴入标准容器100ml容量瓶中同时按F3 标定开始，显示“确认？”后按Enter键，标定正式开始，此时以秒为单位计数，待输出液到达设定的标准容量时，按F4键标定结束，此时，加酸速率便由控制器显示出来，如计数时间为1200秒，加料速率自动显示为5ml/m。也可不经标定直接输入或修正。加碱泵、消泡泵、补料泵的标定同上。2.2参数设置与运行 本系统开机状态直接进入过程参数画面，按ESC键进入主菜单。画面如下按F1进入过程参数模块画面如下按键进入第二副过程参数画面，如下按键切到第一副过程参数画面。2.2.1温度参数 按F1进入温度设置功能模块画

6、面如下按F1输入或修改设定值按F2控制状态切换，按手动、自动、顺控次序显示，在你选择的方式出现“？”按Enter键方式转换，按ESC键取消控制状态切换，按原状态控制。 按F3直接输入手动输出的百分比，不带小数点。2.2.2 PH参数 除单位为PH外数据格式为××.××PH，（0100%）加碱，（-1000）加酸外，其他与2.2.1温度参数相同。转速参数 单位为rpm，手动输出（0100%）其他与温度相同溶氧参数 画面如下按F1输入或修正设定值F2控制方式切换F3溶氧串级参数切换：转速或空气（默认转速）无须确认F4溶氧报警极限设定F5串级转速输出极限设定F

7、6串级空气输出极限设定空气参数 单位为%，数据格式%××.××%，手动输出为0100%，其他与温度一样。压力参数 控制只有手动自动外，其他与温度参数一样。2.2.7消泡参数 画面如下按F1输入或修改消泡的控制周期，单位为秒，不能为0；F2输入或修改消泡的脉冲，单位为秒，脉冲是指控制周期内动作的时间，不大于周期。F3控制方式切换，按手动、自动次序，在你要选择的控制方式出现“?”后按Enter执行控制方式切换，如按ESC则取消控制方式切换即按原控制方式。“手动”表示不加泡沫。注意：泡沫状态1表示有泡沫，此时自动状态才起作用，0表示无泡沫，此时自动状态不起作用

8、；补料参数 画面如下：按F1：输入或修改补料控制周期，单位为秒，不能为0； F2：输入或修改补料控制脉冲，单位为秒，不大于周期： F3：补料控制方式切换，按手动一自动一顺控，当显示你要选择的控制方式(显示“?”)时，按Enter键确认，如按ESC取消控制方式切换，按原控制方式：F4：液位控制周期设置，单位为秒，秒，不能为0：F5：液位控制脉冲设置，单位为秒，秒，不大于周期：F6：液位控制方式切换，按手动 一白动，方式同上，手动表示不加料；以上参数按工艺要求调节，达到发酵温度后对PH、DO电极校正。2.3初始化 画面如下 按F1：输入发酵批号，最多8个数子，不少于一个数字字符。如果不输入批号，直

9、接按Enter键，则按日期自动生成批号。如080809表示8月8日上午9时。注意1此时再按F1进入批号查询功能。2本罐如果在发酵或灭菌状态时，按F1不起作用。2.4.发酵工作的开始与结束切换 如果本批号是新批号，则表示开始发酵，显示“开始确认?”后，按Enter键确认，本批号正式开始发酵，此时如按 ESC则取消发酵开始： 如果本批号正在发酵，按F2则结束，显示“结束确认?” 后，按Enter键确认发酵结束，此时如按ESC则取消发酵结束， 继续发酵。灭菌工作的开始与结束切换，确认方法同F2：注意F2与F3键是互锁的，即发酵时不能灭菌，灭菌时不能发酵。3.灭菌与发酵3.1灭菌前的准备工作校正pH电

10、极的零点(pH6.86)和斜率标定溶氧电极的零点将培养基倒入发酵罐中，盖好罐盖。将电极分别插入罐盖上的对应的孔中并旋紧压盖。排气管用纱布和牛皮纸包好。注意不得将排气口堵死。卸下电极的插头并盖好插口或用牛皮纸包好。卸下空气过滤器顶端的进气胶管，且用夹子夹死过滤器与罐盖空气进口间的硅胶管，以防消毒时培养基倒流。夹紧取样器出口的子，并放松连通取样器顶端口与平衡口间硅胶管中的夹子。将控制pH用的酸碱液、消泡剂及其它的物料分便放入盐水瓶中(装量不得大于总容积的80)并连接好补液管和微孔过滤器(参见图：补液管路装配图)，用纱布包好针头。3.2灭菌锅灭菌将发酵罐、盐水瓶等放入灭菌锅中，盖好牛皮纸。注意：在灭

11、菌过程中，升温和降温速度不宜过快。3.3灭菌后擦干罐底，将发酵罐装在基座上。取下各电极上的遮盖物并连接好电缆。连接夹套冷却水管道、冷凝器冷却水管道。连接空气管道(空气过滤器进口与空气进罐口)，放开过滤器下部的夹子，通过流量计上的针型阀调节流量，当空气进入发酵罐内。驳去排气管末端的牛皮纸(纱布可以保留)，调节空气流量23升分钟。将补液硅胶管装在相应的蠕动泵上。开总电源开关，设定温度、搅拌转速，并将其切入自动控制状态开搅拌马达电源开关，开注水开关直至排水口无气泡排出，关注水当温度稳定在培养温度，正常的空气流量，标定溶氧电极的斜率为100%3.4接种、发酵接种 先准备好酒精、镊子、棉手套等工具。调节

12、进气量为5L/h旋松接种口,将酒精倒入接种口外的槽内，在火焰保护下，用专用手柄打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖。在主菜单画面“初始化”中设定发酵批数并确认发酵开始，否则不记录发酵数据。取样 用夹子夹住取样平衡管，用夹子夹住排气管（允许有气排出），打开取样管上的夹子，由于罐内正压发酵液从取样管流出。取样结束后，关闭取样管夹子，放开排气管和平衡管上的夹子。取样前后要对取料口消毒。发酵过程中根据工艺要求可以对控制参数进行调整。3.5发酵结束在控制器上确认发酵结束，如有必要可将数据存盘，然后退出主菜单，按Ctrl+F6关闭控制程序。关闭搅拌马达电源开关、主电源、关闭水源、气源和总电源收集发酵液，清

13、洗发酵罐并在罐内放一定的水。实验二 酸奶制作一、实验目的 1熟悉酸奶发酵工艺过程。 2了解酸奶发酵过程中物质的变化。 3了解现行乳酸菌的使用方法，发酵工艺技术控制。 二、实验材料纯牛乳 活性乳酸菌 发酵杯 1000ml烧杯 PH计，砂糖 精密试纸4.06.6 10ml吸管 恒温培养箱250ml三角瓶，碱式滴定管 铁架台，酚酞指示剂 0.1000N氢氧化钠标准溶液 三、实验原理 乳酸菌对牛乳中的某些组分进行一系列的代谢过程，产生乳酸等各种风味物质，使牛乳PH下降，形成具有酸奶独特风味的凝固酸牛乳。 酸牛乳中的乳酸来源于乳酸菌对牛乳中乳糖的发酵。属于同型乳酸发酵，它是通过EMP途径代谢生成丙酮酸后

14、，由于大多数乳酸不具有脱羧酶，因此，丙酮酸不能脱羧生成乙醛，而在乳酸脱氢酶催化下（需要还原型辅酶），丙酮酸为受氢体被还原为乳酸。另外，乳酸菌中的酶系利用牛乳中乳糖、蛋白、脂肪等组分形成乳酸、少量的挥发性的脂肪酸和羟基化合物等构成啤酒特有的香味和口味。（主要香气成分为乙醛、丁二酮和3-羟2-丁酮、丙酮及少量的乙醇和挥发性脂肪酸）。乳酸菌的品种，发酵工艺条件的控制会影响发酵副产物的数量差异，正是这种不同造成了酸牛乳之间风味的差异：因此选育优良的产香乳酸菌种，严格控制工艺条件是生产优质酸牛乳的关键。 四、实验步骤 1菌种： 冻干粉 2测定鲜牛乳的滴定酸度和pH值，记录。3牛乳加入6%砂糖，过滤，均质

15、，于85杀菌5min，冷却到45接入乳酸菌种，于42发酵至凝乳PH4.7，冷却至0后熟1224h，测定酸度，要求滴定酸度在70T以上。4. 接种后每1h测定一次PH（用试纸）记录。 五成品检测1. 感官检测：合格产品 色泽，应呈均匀的乳白色或微黄色；滋味和气味：具有酸牛乳固有的滋味和气味；组织状态，组织细腻均匀，允许有少量乳清析出。2. 用吸管准确吸取10ml酸牛乳，加入250ml三角瓶中，加入50100ml蒸馏水，加23滴酚酞指示剂0.1000N氢氧化钠标准溶液滴定至终点，记录消耗的ml数V1。牛乳酸度指每100ml酸奶消耗0.1000N氢氧化钠标准溶液的ml数。牛乳酸度T=NV1÷

16、;0.1×100÷10 式中N氢氧化钠标准溶液当量数 实验中应注意事项1 杀菌时间不易太长，否则会影响产品颜色2 白糖应加水煮沸成糖水再使用。若有杂质，需经过过滤后再用。思考题：牛乳为什么会凝固? 酸度高后为什么有乳清析出？参考资料：1.中华人民共和国标准 酸牛乳GB2746-1999实验三亚硫酸盐氧化法测定溶氧系数KLa值一、实验目的 通过实验掌握亚硫酸盐氧化法测定溶氧系数KLa值的测定方法。二、实验材料 试剂与仪器1 试剂0.1M Na2S2O3标准溶液1000mL：称取25g Na2S2O3·于500 mL烧杯中，加入300 mL新煮沸过的蒸馏水，待完全溶解

17、后，加入0.2g Na2CO3，然后用新煮沸过的蒸馏水稀释至1000mL，保存于棕色瓶中，在暗处放置，10天左右后标定。0.05 MI2标准溶液1000mL：称取13gI2和25gKI于200mL烧杯中，加少许蒸馏水，搅拌至碘全部溶解后，转入棕色瓶中，加水稀释至1000mL，塞紧，摇匀后放置过夜。0.2淀粉指示剂100mL：称取0.2g可溶性淀粉，用少量水调成糊状，溶于100mL沸水（蒸馏水）中，继续煮沸至溶液透明。冷却，贮于玻璃瓶中备用。（新配制）2 玻璃仪器吸管：2mL吸管9支，25mL吸管1支，洗净、烘干；比色管：25mL，9支；碘量瓶：250mL，6支；酸式滴定管：50mL，3根；50

18、0 mL烧杯1个。3 碘量法测定Na2SO3浓度吸取一定的Na2SO3反应液与过量的碘作用生成Na2SO4，然后用标准Na2SO3溶液滴定剩余的碘，根据Na2SO3消耗的体积数，即可求得Na2SO3的浓度。Na2SO3 + I2 Na2SO4 + 2 HI （2）2 Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2NaI （3）三、.溶氧系数KLa值的测定原理 溶氧系数的测定方法有许多种，概括起来可分为三大类，即亚硫酸盐氧化法、动态法和稳态氧平衡法。本实验采用亚硫酸盐氧化法。 以Cu2+作为催化剂，溶解在水中的氧能立即氧化其中的亚硫酸根离子，使之成为硫酸根离子： 2SO3 2- + O2 2S

19、O42- （1）若反应器中装入亚硫酸盐和少量催化剂铜离子（0.5M Na2SO3）水溶液，另加10-3M 的CuSO4），同时进行通风搅拌，则反应器中氧的传递和反应过程可表示为： 气相O2 液相O2 2SO42- 2SO3 2-在常温下，亚硫酸根离子的氧化反应是很快的，其反应速度远大于氧的溶解速度，所以氧一经溶于气相就立即被氧化（反映液中的氧浓度CO）。这样溶氧速度就成了控制氧化反映的决定因素。通过测定反映液中亚硫酸根离子浓度的变化即可测定出溶氧速度。进一步即可计算出溶氧系数。四、实验步骤 1.开机：7升自控机械搅拌反应器，装入0.5 MNa2SO3溶液5升左右（无水Na2SO3315克），调

20、温至25，加入10-3M的CuSO4（1.25克CuSO4 5H2O，配成30mL溶液），开搅拌搅匀（转速300rpm左右），通气，待风量稳定后（通风量10L/min），即可取样测定。 2.取样：用比色管取样，取样前，先用烧杯接反应液20mL左右弃去，然后正式取样（取满），并计时：15分钟左右取第二次样，再过15分钟左右取第三次样，准确记录取样时间。3 .试样分析：用干净移液管于取样试管中吸取2mL反应液于装有25mL标准0.05 MI2溶液的碘量瓶中，加水50mL，然后用标准Na2S2O3溶液滴定至淡黄色，加0.2淀粉指示剂5mL，此时溶液呈深兰色，继续用硫代硫酸钠溶液滴定，至兰色刚好消失。

21、每个样品分析两次取平均值，误差不超过0.1mL。4.计算溶氧速率 （4） 式中：Na体积溶氧速率（Kmol/m3.h）V两次取样滴定硫代硫酸钠溶液的体积差（mL）V0取样分析液体积，V0=2 mLM标准硫代硫酸钠溶液的浓度（Kmol/m3） t两次取样间隔时间，即氧化时间（s） 4换算系数，1molO2相当于4molNa2S2O3，由式（1）（3）有：1mol O22mol Na2SO3，1mol Na2SO31molI2，1molI22mol Na2S2O3，所以，1mol O24mol Na2S2O3溶氧系数 （5） （6） 式中：kLa体积溶氧系数（1/h） c* 氧在液相中的饱和溶氧浓

22、度，在该反应条件下，c*=0.21*10-3 KmolO2/m3 c反应液中的实际溶氧浓度，在亚硫酸盐氧化法条件下，由于反应很快，而氧的溶解较慢，所以氧一经进入液相即被反应，实际上液相氧浓度c=0。 则： （7） 5.实验结果 表1 溶氧实验结果计算表 试验日期反应液组成0.5M Na2SO3水溶液，另加10-3M的CuSO4试验基本条件反应液体积： L反应温度： 通风量： L/min搅拌转速： r/min两次取样时间间隔（s）两次滴定Na2S2O3体积差V（mL）Na2S2O3的溶液浓度（mol/L）体积溶氧速率Na（Kmol/m3.h）体积溶氧系数kLa（1/h）kLa平均值（1/h） 附

23、：0.1M硫代硫酸钠标准溶液的标定 1.试剂固体K2Cr2O7基准物：取5克左右分析纯固体K2Cr2O7于称量瓶中，130140烘干2小时后，移入干燥器中备用。6MHCI，100mL。固体KI。0.2%可溶性淀粉，100mL。0.1M硫代硫酸钠溶液，1000 mL（待标定）2.标定准确称取K2Cr2O7基准物0.15克左右于250mL碘量瓶中，加水25mL，使之溶解后，加固体KI 2克，及6NHCI5mL，立即盖好瓶塞，摇匀后用水封。在暗处放置5分钟后，拔掉瓶塞，使瓶口水入瓶内，加水50mL，并用洗瓶吹洗碘量瓶内壁，用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈浅黄色（或黄绿色）。加入5mL0.2%淀粉指示

24、剂，此时溶液呈深兰色，继续滴定至兰色消失而变为Cr3-的绿色为止。3.计算MNa2S2O3溶液的摩尔浓度（mol/L）V滴定时所用Na2S2O3溶液的体积（mL）W基准物K2Cr2O7的重量（g）EK2Cr2O7的克当量，E=49.034.结果整理表2 硫代硫酸钠溶液的标定结果 标定日期序号123K2Cr2O7的重量W（g）Na2S2O3的体积（mL）M=20.40 W/VM平均值（mol/L）实验四酒精发酵培养基的制备一、 实验目的学习并掌握淀粉水解糖的制备原理及其制备工艺，了解双酶法制糖的操作工艺过程。掌握酒精培养基的配置方法二、 实验原理工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的“糖化

25、”，所制备的溶液称为淀粉水解糖。淀粉水解糖液中，主要的糖类为葡萄糖。此外，根据水解条件的不同，尚有数量不等的麦芽糖、低聚糖等。淀粉水解糖液质量的高低直接关系到酒精的积累。常用的水解淀粉的方法有酸解法、酶解法、酸酶结合法。双酶水解法是用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。同时在整个水解过程中一部分葡萄糖发生复合反应和分解反应，影响葡萄糖的产率和生产成本。淀粉的水解反应式：(C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6淀粉各种湖精麦芽糖葡萄糖三、 实验材料与设备（玉米淀粉制糖）玉米淀粉，CaCI2, a-淀粉酶，碘溶液，糖化酶，尿素，纯碱（Na2CO

26、3）,硫酸，玻璃搅拌棒，烧杯1000ml1个、500ml、250ml2个，恒温水浴锅，高压灭菌锅、温度计、糖化计、量筒。四、 实验步骤（一）淀粉水解糖的制备1、 加水拌料：采用12.53的加水比调浆，水温6070拌料。如：称取240g玉米淀粉，加水600mL2、液化：采用中温蒸煮糊化工艺，并加入相当于淀粉含量0.3%的CaCI2作为淀粉酶的保护剂，中温淀粉酶用量淀粉含量的0.2%，温度8590，液化120分钟。检验：（1）碘液变为棕红色（2）糖度1020Be3、 糖化：降温至60并调pH至4.6，按照150u/g淀粉的量加入糖化酶，糖化30分钟。（二）培养基配置（自己设计培养基的配比）1、 取

27、淀粉水解糖液1000 mL烧杯中。2、 加入氮源尿素、硫酸铵、磷酸铵。一般C/N=100/0.22.03、 调pH4.75.0纯碱（Na2CO3）,硫酸4、4、灭菌121，20分钟。五：思考题1、 酶解法有何优缺点？六、实验中应注意的问题1、加水拌料时用的水 温水（6070）2、淀粉水解时水浴锅的温度设置，应以料液容器中的温度为准。实验五 酒精发酵实验一、 实验目的学习并掌握酒精发酵的操作工艺过程，了解酒精发酵过程中合成途径。二、 实验原理酒精发酵作用，是酵母菌把可发酵性的糖，经过细胞内酒化酶的作用，生成了酒精与CO2，然后通过细胞膜将这些产物排出体外。因为酒精发酵是在水溶液中进行，酒精是可以任何比例与水混合的，所以由酵母体内排出的酒精便溶于周围的醪液中。酒精发酵葡萄糖酵母菌的酒化酶作用下生成酒精。三、 实验材料与设备活性干酵母、蔗糖、天平、发酵培养基、调pH4.75.0纯碱（Na2CO3）,硫酸，恒温培养箱、电磁炉、锅四、 实验步骤 1 干酵母的活化： 取2克蔗糖放入100ml水中，烧开晾凉至25，称取4克活性干酵母放入以上糖水