环介导等温扩增技术及其在沙门氏菌检测中的应用2

1、环介导等温扩增技术及其在食品中沙门氏菌检测的应用摘要:本文主要综述了环介导等温扩增技术(LAMP）的原理、优缺点及其在食品中沙门氏菌检测中的应用现状，并展望了环介导等温扩增技术在食品病原菌快速检测中的应用前景。关键词：环介导等温扩增技术；LAMP；沙门氏菌Loop-mediated isothermal amplification technology and its application in the detection of salmonella in foodAbstract: The principles of Loop-mediated isothermal amplificati

2、on (LAMP) , and also its the advantages and disadvantages were introduced in this paper, as well as its recent application status in the detection of salmonella in food. Finally, the prospect of the application of the LAMP technology for rapid detection of pathogens in food was given.Keywords: Loop-

3、mediated isothermal amplification technology; LAMP; salmonella沙门氏菌病是一种最为常见的食源性疾病，是英国、澳大利亚、美国等国家主要食源性疾病的病因1。美国CDC（疾病预防与控制中心）的监控数据显示，在2009年，沙门氏菌引起的中毒病例占细菌感染型食物中毒病例中的一半以上2。在中国内陆地区，每年发生的细菌性食物中毒事件占中毒事件总数的30%-90%3。在引发细菌性食物中毒的病原菌中，沙门氏菌约占40%4屡居首位。从食品中分离和检测沙门氏菌，当前大多数国家和国际ISO标准等均沿用传统的细菌学分离方法。尽管方法证明可靠，但利用其得到阳性

4、和阴性结果需要47天，且费时、费力，在日常监控、暴发事件病原体确定和溯源等方面存在着瓶颈。为了寻求准确、快速、简便的检测技术和方法，国内外学者进行了大量的研究，一些分子生物学技术，如PCR5、链置换扩增6、依赖核酸序列扩增及再生式序列复制反应7等在沙门氏菌等病原菌的检验与诊断方而发挥了重要的作用。然而，分子生物学技术检测核酸对仪器设备的要求，操作程序的复杂、技术要求较高等原因限制了其作为快速诊断方法的开展与推广。Notomi等在2000年建立的环介导等温扩增技术8 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)解决了以上难题。目前，该技术己经应用于

5、沙门氏菌等病原体的快速检测中。1环介导等温扩增技术1.1环介导等温扩增技术的原理环介导等温核酸扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用具有链置换活性的Bst (嗜热脂肪芽胞杆菌）DNA 聚合酶在恒温条件(65 左右)保温60分钟，即可完成核酸扩增反应，通过肉眼或者荧光染料SYBR Green I（EvaGreen荧光染料）染色后，在日光下进行判定。针对靶基因扩增产生各种大小的茎环状DNA混合物，副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。与PCR相比，LAMP具有快速（30120分钟），简便（普通恒温水箱），直观（肉眼可以观察结果），特异（4条引物）、

6、等温高效（一个温度）及不需要特殊仪器等优点，有利于实验室条件较差的机构开展食品安全相关病原体的核酸检测。1.2引物设计由于环介导等温扩增是通过两对引物即两条外部引物和两条内部引物与6个不同区域的相互识别来产生扩增效应，环介导等温扩增对引物特异性的要求更高，设计也更为复杂。LAMP引物设计一般选取一段长约130 200bp（最长300bp，不可超过500bp）8的保守序列作为内部引物扩增目的序列。每条内部引物的两段DNA短片段通过TTTT序列连接8，也有研究结果认为在内部引物之间不加TTTT序列并不影响等温扩增，说明TTTT序列在串联内部引物上并不是必需的9。最近Nagamine K等的研究提示

7、在LAMP反应中加入环引物能够明显加快等温扩增的速度，大大提高了检测效率，检测率比没有加环引物的高7个数量级10, 11。1.3扩增反应DNA在65左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链12。在链置换DNA酶作用下内引物与外引物依次进行链置换扩增反应，LAMP法基因扩增循环的起点结构即两端茎环结构的单链得以形成，反应正式开始。由于反应过程中内外引物的作用不同，内、外部引物浓度的比例要进行优化，各成分的最佳浓度具有不确定性。一般来说，内部引物和外部引物的浓度比为1 : 41 : 1013。1.4结果判定环介导等温扩增结果判定主要方法

8、有：（1）电泳，将扩增产物电泳后在紫外灯下观察可见扩增产物呈梯状条带；（2）直接观察扩增管的浊度。研究发现LAMP阳性扩增管反应后形成副产品焦磷酸镁，而没有发生扩增反应的阴性管中没有副产品焦磷酸镁产生，因此阳性管的浊度比阴性管高，经高速离心后出现更为明显的白色沉淀，阴性对照管则没有白色沉淀14；（3）加入染料直接用肉眼判定结果。有研究者向其扩增产物中加入能掺入到双链DNA中的荧光染料SYBR Green I，发现电泳结果阳性管加入染料后颜色变为绿色，而没有目的DNA片段扩增的阴性对照管颜色没有发生变化，这一发现使得LAMP结果的判定更为简捷13, 15, 16。（4）利用专门的仪器。日本荣研株

9、式会已经利用LAMP反应过程中会生成白色沉淀副产物焦磷酸镁这一特点，研制出专门用于LAMP检测的实时监控终点浊度仪，它可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控。从而使扩增和检测一管一步完成。2 LAMP的技术特点2.1 LAMP的技术优点：反应迅速高效，不需要双链DNA的预热变性，核酸扩增一般在1h内均可完成。这对于快速诊断十分重要，便于医生及时获得临床检验结果、决定治疗方案。与定性PCR相比，LAMP法的检测率要比其高出12个数量级，具有荧光实时定量 PCR同样的灵敏度，能满足低拷贝数样品的检测，扩增产物靶序列可达到109以上。有研究发现，环引物的加入使得其检测的灵敏度更高，在极低模板量(0

10、.01 PFU)即可获得结果11。由于是针对靶序列6个区域设计4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高。扩增过程不需特殊仪器，扩增结果判定不需要对产物进行电泳，而可直接用肉眼观察扩增管浊度，或通过向其扩增产物中添加荧光染料再通过颜色变化来判定结果，操作简单。2.2 LAMP的技术缺点引物设计有难度，尤其对GC含量低的短片段。引物设计涉及6个区域的4条特异性引物，要避免引物之间二聚体的形成。长引物的二级结构，不同引物不同的熔解温度，F2/B2，F3/B3的3端和F1c/B1c的5端的自由能最佳改变值等因素17都要考虑。试剂价格高，所使用的酶为具有链置换活性

11、的Bst DNA 聚合酶，反应体系有时需要加甜菜碱、硫酸铵优化以获得更高的反应速率。极其微量的核酸污染即可造成结果的假阳性的可能。扩增产物为混合物，克隆纯化有难度。3 LAMP技术在食源性沙门氏菌检测中的应用分离培养方法检测沙门菌需要经过非选择性增菌、选择性增菌、筛选可疑菌落、生化和血清学鉴定这几个步骤，得到阴性结果往往需要4天左右，检出沙门菌至少需要7天；血清学鉴定也存在效价低，试剂昂贵等不足之处。LAMP方法可以在24 h 内检出食品中的沙门菌，相比分离培养法更快速，这对于生鲜食品的安全检测和食物中毒的快速检测具有一定的意义。Hara-Kudo Y 等利用LAMP对沙门氏菌亚种肠道菌的39

12、个血清型220株分离株和沙门氏肠道菌亚种的7株分离株进行了检测，根据反应体系的浊度变化以及其中荧光染料荧光强度的变化检测产物，结果显示，全部220株沙门菌得到阳性结果，反应特异性高，该法的检测限为2.2 cfu/反应管9。Ohtsuka等18利用LAMP方法检测鸡蛋清中的沙门菌，并采用传统的培养方法和PCR方法进行平行检测，结果显示， LAMP方法和培养方法都成功地检测出全部110个样品中的沙门菌，PCR方法漏检了其中10%的阳性样品，但相比于培养方法， LAMP方法速度更快，检测灵敏度更高，更具有实用意义。万进等19以沙门氏菌高度保守基因fimY基因为靶基因设计两对引物（F3&B3、

13、FIP&BIP），建立LAMP反应体系。经试验分析对体系特异性、Mg2+浓度、反应时间、反应温度进行了优化和摸索，对35株临床菌株均检出达100，其他阴性菌株基因组均无检出，在人工添加样品检测得其在牛奶中灵敏度为33CFU/管。实验结果表明，该方法耗时少、具有高特异性，适合牛奶中沙门氏菌污染的快速检测。王羽等20针对沙门氏菌的特异基因 invA 基因设计两对LAMP引物，建立LAMP检测沙门氏菌的新方法，并对肉及肉制品中的沙门氏菌进行检测。结果表明：建立 LAMP 技术检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法，该方法能够特异检测沙门氏菌，且灵敏性可达10-9CFU/mL，对48份样品检测，该方法

14、检出率为91.6%、敏感性 100%、特异性70.0%、符合率为93.8%、检出时间1.5h。在食品检测中，LAMP法是对沙门菌属的通用检测方法，但不能进一步鉴定分型和分离菌株是其不足之处；故可以将LAMP方法配合传统分离培养法对食品中沙门氏菌进行食品卫生检测，LAMP检测发现阳性结果后再利用分离培养法进行沙门菌的鉴定分型和菌株分离。4 展望LAMP技术在提高PCR等分子生物学方法的特异、敏感等优点的同时，克服了模板的热变性、长时间的温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等复杂过程的缺点，不需要昂贵仪器设备，操作更为简便，为食源性致病菌的检测提供了新的技术方向。目前 LAMP 技术的研究主要集中在产物

15、检测的方便性和反应速度上，各国科技工作者都在努力提高反应速度、缩短反应时间、找到简便的产物检测方法，以更好地应用于基层临床诊断和现场检测。凭借其操作简单、特异性强、可以在短时间内快速获得大量特异性扩增产物、扩增产物易判断、不需要昂贵的仪器和试剂等优点，LAMP 技术非常适用于食品中即时、快速简便的大样本量检测要求，在食品病原微生物检测领域有着非常广泛的应用前景。总之， LAMP技术将来有望成为国内应对突发公共食品安全事件的有力检测手段。参考文献1Scallan E, Hoekstra R M, Angulo F J, et al. Foodborne Illness Acquired in t

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