美国FDA关于抗HIV药物的临床前药效学评价标准_陈欢

1、美国FDA关于抗HIV药物的临床前药效学评价标准 陈欢网络出版时间:2012 9 1810:16 网络出版地址:http :/www cnki net/kcms/detail/34 1086 R 20120918 1016 201210 1352_006 html美国 FDA 关于抗 HIV 药物的临床前药效学评价标准陈欢 1, 2, 王睿睿 1, 郑永唐1(1 中 国 科 学 院 和 云南 省动物模型与人类疾病机理 重点实验室,中 国 科 学 院昆 明 动物研究所, 云南 昆 明 650223; 2 中 国 科 学院研究生院, 北 京 100049) b5E2RGbCAP收稿日期:2012

2、05 23, 修回日期:2012 07 23基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973 计划 ) 资助项目(No2009CB522306) ; 国家科技重大专项“ 十一五 ” 计划课题(No2009ZX09501-029) ; 国家自然科学基金青年基金资助项目 (No81001462)p1EanqFDPw作者简介: 陈欢 (1988 ) , 女 , 硕士生 , 研究方向: 抗 HIV 药物 , Tel E-mail :qingxing1214163 com ; 郑永唐 (1962 ) , 男 , 博士 , 研究员 , 博士生导师, 研究方 向 : 病毒免疫学和抗

3、病毒药理学, 通讯作者,Tel /Fax E-mail :zhengytmail kiz ac cnDXDiTa9E3ddoi :10 3969/j issn 1001 1978 201210006文献标志码:A 文章编号:1001 1978(2012)10 135204中国图书分类号 :R927; R969; R978 7RTCrpUDGiT摘要 : 药物治疗是目前唯一有效治疗艾滋病的手段, 而我国 至今尚无自主知识产权的抗HIV 药物上市, 5PCzVD7HxA药物研发的任务紧迫且艰巨。 药物的临床前药效学评价对后续的临床实验具有重要的指导意义。 该文以 Etr

4、avirine 为例 , 介绍和讨论 FDA 抗 HIV 药物的临床前药效学评价指导原则, 分析了 抗 HIV 药物临床前药效学研究部分的实验要点和重点, 希 望为完善符合我国国情的抗HIV 药物临床前研究标准提出参考 。 jLBHrnAILg关键词 :FDA ; 指导原则; 抗 HIV 药物 ; 临床前 ; 药效学 ; Etra-virine xHAQX74J0X人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus , HIV ) 会导致获得性免疫缺 陷 综合症 (acquired immunodeficiency syndrome , AIDS ) 的发生 。 自从 1

5、981 年人类发现HIV 病毒 以来 , LDAYtRyKfE人类就在为战胜艾滋病不懈努力。 1987 年 , 第 1 个抗 HIV 药物zidovudine 获得美国FDA 的批准并上市, 给治疗 AIDS 带来了希望。 经过 30年的不懈研究, 美国 FDA 总共批 准上市了26 种抗 HIV 单体药物和9 个固定配伍复方药物。 FDA 批准的抗HIV 药物中 , 单体药物包括8 种核苷类逆转录酶抑制 剂 (nucleoside reverse transcriptase inhibitors , NR-TIs )、 4 种非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside revers

6、e transcriptase inhibitors ,NNRTIs ) 、10 种蛋白酶抑制剂(prote-ase inhibitors , PIs )、1 种融合抑制剂 (fusion inhibitors , FIs )、1 种辅助受体抑制剂(co-receptorinhibitors , CRIs ) 和 1 种整合 酶链 转 移 抑 制 剂 (integrase strandtransfer inhibitors , INS-TIs ) 1。 采用多种抗HIV 药物配伍的高效抗逆转录病毒疗Zzz6ZB2Ltk法 (highly active antiretroviral therap

7、y , HAART )治疗 HIV 感 染者 ,虽然无法治愈AIDSdvzfvkwMI12 3, 但可明显地延长患者生命和改善患者生活质量。 然而 ,HAART台疗存在毒副作用大、依从性差、易产生耐药性、 无法清除体内病毒等缺点。 所以 , 寻 找新的药物作用靶点 , 研发具有高效低毒的抗HIV 新药 , 降 低治疗成本, 具有十分重要的意义 。 rqyn14ZNXI目前我国用于免费临床治疗的抗HIV 药物约 9 种 , 其中 大多为专利过期的仿制药物, 品种少 , 且毒副作用大, 无法满 足临床需求。 我国至今尚无一种具有自主知识产权的抗HIV 药物用于临床4, 作为中国这样一个大国, 如果

8、仅仅依 靠仿制抗HIV 药物来解决国内的治疗艾滋病问题, 科学界 和医药界人士不管有什么样的理由, EmxvxOtOco都是没有说服力的。 因 此 ,立足自主创新, 研发具有自主知识产权的治疗艾滋病等重大疾病的原创性药物 , 为国民提供安全、 有效和价廉的药物 , SixE2yXPq5满足人民日益增长的医疗需求, 对我国人民的健康和社会的可持续发展有着重大战略意义, 对于维护国家安全和社会稳定还将发挥不可替代的重要作用。6ewMyirQFL研发新药是个漫长的过程, 而临床前的研究工作尤其重要 , 临床前药效学研究是新药研发的基础, 也可为临床实验提供有效的参考价值。 开展规范的临床前药效学研究

9、, 可以 推进我国抗HIV 药物的研发。 本文以 2008 年上市的Etra-virine 为例 , 结合我们多年从事抗HIV 药物临床前药效学研究的经验,介绍和讨论了FDA 批准上市药物的临床前药效学评价的各部分实验内容, 分析了 FDA 对于抗 HIV 药物临 床前药效学研究部分的实验要点和重点, 希望借鉴美国 FDA 的抗 HIV 药物的临床前药效学评价, 有助于制定和完善符合我国国情的抗 HIV 药物的临床前药效学评价标准和指导原则 。1 kavU42VRUs美国 FDA 对抗 HIV-1 药物临床前研究指导原则美国 FDA 对于抗病毒药物的临床前评价及抗HIV 药物 的耐药性评价,

10、出具了一系列的指导原则。 本文主要从以下几个方面进行阐述: 试验药物的抗病毒活性研究、 试验药物的毒性和治疗指数研究、 试验药物的作用机制研究、 试验药 物的 HIV 耐药性及交叉耐药研究5 y6v3ALoS89。1 1试验药物抗病毒活性研究抗病毒活性研究主要针对试验药物的体外抗病毒活性, 药物与血清结合的能力, 联合 用药效果, 体内抗病毒活性这几方面来进行。1 1 1M2ub6vSTnP体外抗病毒活性研究HIV 能够在外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells , PBMCs ）及细胞系中完成其完整的生命过程, 所以可以在细胞水平检测药物的抗病

11、毒活性 。 采用 HIV 实验株 、 耐药株和临床分离株感染细胞0YujCfmUCw系或PBMCs的实验体系,进行定量的抗病毒活性研究,并且 计算药物的半数有效浓度EC 50（ 在生物化学或亚细胞实验中用 IC 50 表示 ） 或者90%有效浓度 EC 90, 以证明药物具有一定的抗病毒能力。 FDA 建议研究者评价所研究药物对一系列的包括不同型、 亚型或基因型的HIV 病毒实验株和临床分离株的抗病毒活性, 并且评价药物在不同细胞中的抗病毒活性 , 包括淋巴细胞和巨噬细胞 6 。 eUts8ZQVRd1 1 2血清 结 合实验 血清蛋白的存在对很多药物具有屏蔽作用 。 血清蛋白可以与药物相结合

12、, 从而阻止药物进入细胞发挥其作用7 。 FDA 建议研究者们对血清存在的情况下的药物抗病毒活性进行评价。 通常可以采用平衡透析、超滤、基于荧光技术的高通量人血清白蛋白及a-酸性糖蛋白 结合试验测定药物的血清蛋白结合率。 如果药物的血清结合率高 , 则建议研究者测定血清存在的条件下的药物体外抗病毒活性。 计算在不同比例的人血清存在条件下药物的ECsQsAEJkW5T50, 并推算 100%人血清条件下药物的抗病毒活性。 必要 的时候还应检测在人血清白蛋白（HAS ）和a-酸性糖蛋白（AAG ）存在条件下药物的抗病毒活性。GMsIasNXkA1 1 3体外联合用药 由于 HIV 的高突变性和容易

13、产生耐药性的特点,临床上至少应该使用2 种不同类型的3 种抗 病毒药物进行联合用药8, 一般是2种 NRTIs 和 1 种 NNRTI 或 PI 9 10。 在临床实验之前, 还应评价试验药物与其它已获批准的抗HIV 药物之间联合用药的抗病毒活性。 一般从 两个方面进行 :(1) 评价与试验药物相同靶标的药物联合用药的抗病毒活性; (2) 评价不同靶标的药物联合用药的抗病毒活性 。 可以通过设定不同比例的药物含量,测定病毒对联合用药的剂量反应曲线。 确定单独用药的EC 50 及联合用药的EC 50, 评价联合用药的几种药物相互作用的表现是增强、 拮抗或者协同作用。体外联合用药实验的进行可以有效

14、预测药物临床应用配伍方案。 TIrRGchYzg1 1 4 抑制指数(inhibitory quotient , IQ )研究 了解血浆与细胞内代谢产物的浓度, 对于评价剂量相关的抗病毒治疗和潜在耐药性的发生具有重要作用 。 从而引入抑制指数(IQ ) 的概念 。 IQ 的值为 C min / 血清结合实验EC 50(C min 为药物下次给药之前, 待测部位药物的最低浓度) 。 IQ 可以有效的体 现药物的暴露和病毒对药物敏感性的关系。 IQ 值高表示药物可以在有效浓度内抑制病毒并把耐药性产生的可能性降到最低 5 。 7EqZcWLZNX1 1 5体内抗病毒活性研究药物体外细胞水平的药效学评

15、价完成后, 有条件的情况下应尽快进行药物的临床前体内药效学研究。 利用较合适的艾滋病动物模型, 如 SIV / 猕猴 模型或 SHIV / 猕猴模型, 对药物的体内抗病毒活性进行研 究 , 为人体试验提供实验依据, 并且将对后续的临床研究提供更充足的数据参考 。 动物感染模型给药后主要检测的指标有发病率和死亡率、 组织学检查 、 各时间点病毒载量、 耐药 性病毒的分离和鉴定、 病毒抗原和抗体的定量检测 , 以及药 代动力学数据和症状。 lzq7IGf02E1 2体外毒性研究及治疗指数在进行抗病毒活性检测的同时 , 还应该对药物细胞毒性进行评价。 毒性研究的重要性在于排除药物的抗病毒活性可能是由

16、于药物对宿主细胞的毒性所造成的细胞死亡而产生的影响。 进行毒性研究时,应 该采用药物浓度梯度稀释的方法, 直接对细胞进行作用, 计 算药物的半数细胞毒性浓度CC 50 或 CICC 50( 药物造成50%细胞死亡时的浓度) 。 所用的细胞与评价抗病毒活性时所用细胞要一致。 对于病毒对药物的代谢会产生一定影响的药 物 , 要求分别评价感染和未感染时的细胞毒性。 通过细胞毒性和抗病毒活性的研究, 可以计算出治疗指数(therapeutic indexes , TI ) 11。 TI 是CCzvpgeqJ1hk50与 EC 50 的比值 , 药物的 TI 高 , 则 表示药物的抗病毒活性大, 且细胞

17、毒性小 。1 3药物作用机制的研究药物作用机制的研究, 对于探 讨病毒对药物的耐药性研究及临床研究都具有十分重要的价值 。 在进行临床试验之前, 应该尽可能了解药物的抗病毒作用机制, 以预计可能出现的耐药位点及耐药突变出现的频率 。 药物作用机制的研究主要包括确定药物特异性抑制病毒复制或病毒特定功能的活性, 以及确定药物作用靶点, 并 且比较药物对病毒的作用靶点和药物对宿主细胞或蛋白作用的选择性。 对于抗 HIV 药物来说, 病毒的进入、 逆转录 、 入核 、 整合 、 后期蛋白的合成等生命过程都可以考虑作为药物作用的靶点 12 。 可以针对病毒的这些生命过程, 设计实 验 , 确定药物是作用

18、于病毒生命过程中的哪个过程。 例如 , 可以进行药物对病毒逆转录酶的抑制实验、融合阻断、 蛋白 酶抑制实验等, 并计算 IC 50 或 EC 50。 如果细胞实验得到的 NrpoJac3v1EC50低于机制实验中的EC 50, 则该药物可能是多靶点。1 4耐药性研究HIV具有高度变异性, 这导致 HIV 病毒 很容易产生耐药性。 耐药性的产生和传播是 AIDS 抗病毒治疗失败的一个重要原因13 。 因此 , 关于病毒对抗HIV 药物 的耐药性及交叉耐药的研究对于药物的研发重要性是不言而喻的 。 抗 HIV药物的耐药性研究, 可以提供病毒感染过程中发生耐药性突变的相关信息14 。 虽然体外耐药性

19、研究结果可能与临床的耐药性研究结果不完全相同, 但是进行体外耐药性检测可以为临床实验提供重要的参考依据。 通过对药物作用机制的研究, 判断可能出现的耐药位点 , 这些耐药位点不一定仅限于药物的作用靶点 , 也可能出现在与该靶标相互作用的相关酶或蛋白的位点。 耐药性研究主要关注的问题是药物对HIV 耐药株的抗病毒活性、 药 物是否容易诱导病毒产生耐药株及耐药株的基因型和表型特性 。 1nowfTG4KI1 4 1 多种 HIV-1 耐 药 病毒 株的选择选择的耐药株一般要求有 1 2或者多个突变, 并且在不同的选择压力下, 培养 分离得到针对该药物的耐药株并进行基因型和表型的鉴定 。 有两种方法

20、: 一是采用较高的耐药株病毒滴度感染细 胞 , 并用固定浓度的药物作用, 测定不同的病毒滴度下的药物作用活性;二是采用低病毒滴度感染, 并从 EC 50 值开始增加药物浓度的方法, 筛选得到耐药株 15 。 可以采用DNA 测 序的方法鉴定得到的耐药株的基因型。 fjnFLDa5Zo2 4 2 药 物 的交叉耐药 研究 HIV 病毒对一种药物产生耐药性后 , 该突变株往往对同一类的抗病毒药物会产生交叉耐药性 16 。 应该对该药物以及所有与该药物相同类型的已批tfnNhnE6e5准药物和其他相同类型的试验药物进行交叉耐药研究。 应 选择野生型病毒株为对照, 对临床分离的耐药株及诱导耐药株进行交

21、叉耐药研究。 HbmVN777sL1 4 3 耐 药 病毒 株的 基因型及表 型 特 性研究 分离得到耐药病毒株后 , 应进行耐药株的基因型和表型的特性研究。 基 因型特性研究为确定 病毒 产 生 耐 药 性 的 突 变 基 因 , 通 过 DNA 测序等确定突变位点, 并比较不同突变类型导致耐药性的不同表型特性研究的结果决定于耐药株的敏感度和 药物的浓度。 应该对比药物对野生型病毒的抗病毒活性和对耐药株的抗病毒活性 。 V7l4jRB8Hs 2Etravirine 的抗病毒临床前药效学研究2 1Etravirine 的作用机制Etravirine 是 2008 年获得 FDA 批准上市的非核

22、苷类逆转录酶抑制剂, 代号TMC125。其直 接作用于HIV 的逆转录酶(reverse transcriptase , RT ) ,阻断其 RNA 依赖的 DNA 聚合酶活性及DNA依赖的DNA聚合酶活 性,而对人的a , B , 丫 DNA聚合酶不造成影响。共结 晶和分 子模拟实验表明, TMC125 是一种具有柔性结构的分子, 能 以多种构象结合到 HIV-1 逆转录酶的非核苷类逆转录酶抑制剂结合口袋区17 18, 并且至少有2种结合模式。这种柔性结构使得TMC125能够结合多个不同的构象变 形体。可 能由于TMC125的这种结构特性,增强了它和HIV-1的逆转 录酶结 合效率 , 包括

23、其他非核苷逆转录酶抑制剂的耐药株逆转录酶 。 83lcPA59W93 2 细胞培养下Etravirine 的抗病毒活性以 Efavirine (EFV ) 为阳性对照药,分别评价了 TMC125S MT4 PBMCs、原代人单核巨噬细胞中的抗野生 型HIV-1, HIV-2, 和SIV 病 毒活性18。HIV-1包括如下病毒株：田B , Bal , HXB2D , MN , NL4-3, SF2 及 U455。 ECmZkklkzaaP50范围为0. 87nmol - L -1 5.46 nmol L 1。 同时分别检测了 TMC125fc PBMCs中对25种 临床分离株的抗病毒活性。这25

24、种HIV-1临床分离株 22 株来自 M 组 , 3 株来自 O 组 , 包括不同亚型和不同嗜性的病毒株 ,EC 50 分另I为 0. 71nmol - L 1和 21.7nmol L 1。AVktR43bpwTMC12凯 HIV-2ROD 活性的 EC 50 范围为5. 67 7. 10 仙mol L -1,对 SIVmac251 的 EC 50 为 3. 33 N mol - L - 119。 对HBV、HCV 、HSV-1、HSV-2、 人类 冠 状 病 毒等进 行TCM125的 抗病 毒活性 检测 发现, TMC125只 特 异 性 的对HIV-1有效, 而对这些病毒无效。 ORjBn

25、OwcEd较之早前批准的抗HIV 药物, TMC125的抗病毒活性研究中采用了更多的病毒株 , 尤其是不同亚型的临床分离株, 可见 FDA 对抗病毒活性研究部分越来越注重对临床应用的指导意义, 加强临床分离株活性检测非常重要。 2MiJTy0dTT2 3Etravirine 细胞毒性与治疗指数研究对 MT-4、HeLa 、 Hep-2 、 HepG2、MRC-5 A549等细胞进行了 TMC125的细胞毒性检测,作用3d的CC 50 为15 40以mol L 1,作用5d后 gIiSpiue7ACC50均大于100 mol - L -10以MT-4细胞为例，计算其治疗 指数大于 6250019

26、 。 uEh0U1Yfmh2 4Etravirine 血清蛋白结合研究在体积分数为0. 1 的 FBS 培养基中分别加入体积分数为0. 5的人血清，45g L 11Ag9qLsgBXHSA或者1g L 1AAG ,检测TMC125的抗病毒活性，EC 50 比值(在血清存在的情况下的EC 50 和不存在的情况下EC 50 的比值 , 结 果 为 多 次 重复 的 平 均 数 ) 分 别 为 5. 8 、 4. 3 和 1. 819 。 由此可看出, 相对于AAG , TMC125更容易与 HSA 结合。WwghWvVhPE2. 5Etravirine的体外联合用药抗病毒活性研究分别测 定了 TM

27、C125t已获批准上市的4 种 NNRTIs , 7 种 NRTIs , 9 种 PIs 及融合抑制剂enfuvirtide(EFN ) 联合用药的抗病毒活性 。 分别设置3 ? 1 、 1 ? 1 和 1 ? 3 三个药物浓度比例 , 计 算 EC 50。 从联合用药的结果来看, TMC125 对所有其他药物均无拮抗作用 , 对大多数药物有增强活性的作用。 与 zidovu-dine (AZT )、lamivudine (3TC ) 和 emtricitabine (FTC ) 具有 协同作用。 asfpsfpi4k2 6Etravirine 体外耐药性研究在体外耐药性研究中, 分 别检测了

28、TMC125勺耐药性及与其他药物的交叉耐药。在 耐药性研究中，用高MOI的耐药株感染细胞, 梯度稀释药物 , 检测药物的抗病毒活性。 用多种不同的实验耐药株和临床分离 耐 药 株 , 比 较 不 同 NNRTIs 的 耐 药 性 。 结 果 显示 , TMC125 与 EFV 和 nevirapine (NVP ) 相比较 , 比较不容易产生耐药性,且 对 部 分 NVP 和 EFV 耐 药 株 具 有 抗 病 毒 活 性 20 21。 采用低 MOI 的病毒感染细胞并增加药物的浓度, 在药 物 浓 度 压 力 下 分 离 出TMC125勺耐 药突变，检 测TMC125对其的抗病毒活性，以及分

29、析耐药株的 突变位点，分析其基因型。分别检测了 TMC125寸NRTI-和PI-ResistantHIV-1 临床分离株的抗病毒活性及对NNRTIs 点突变耐药株的抗病毒活性。 结果表明 , TMC125 对 NRTIs 和 PIs 耐药株 均不表现明显的耐药性, 与efavirenz 存在交叉耐药。 ooeyYZTjj1较之早前批准的抗HIV 药物 , TMC125 的耐药性研究部分工作量明显增加,不仅采用多株实验耐药株和临床耐药株 , 还采用了两种体外诱导耐药的方式对TMC12删耐药性机制进行细致的研究，整个耐药性研究占临床前药效学研究的很大比重, 可见 FDA 对抗 HIV 药物耐药性研

30、究工作的重视 。 BkeGuInkxI3 结语根据我国实际情况和抗HIV 临床前药效学研究现状, 借鉴美国FDA 的临床前药效学评价指导原则, 充分利用现有的资源, 根据我国流行HIV 毒株的情况 , 适当增加不同亚型不同嗜性实验株和临床分离株的种类, 进行抗病毒活性研 究 。 从 etravirine 体外耐药性研究实验报告可以看出, 为了 更好地预测临床用药的情况, 美国 FDA 越来越注重耐药性研究的工作, 提示我们在抗HIV新药研发过程中也应增加耐药毒株的种类更加深入地进行耐药性研究。 PgdO0sRlMo抗 HIV 药物的临床前药效学评价, 是抗 HIV 药物研发的重要阶段, 该过程

31、为临床研究的实验设计提供了数据依据 。 在体外药效学评价完整的情况下,鼓励进行体内药效学评价 。 在进入临床试验之前, 应该进行完整的临床前药效学 评价 , 为临床试验提供充足的数据和参考依据。 3cdXwckm15参考文献:1Este J A , Cihlar T Current status and challenges ofantiretroviral research and therapy J Antiviral Res , 2010,85(1) :25 33 h8c52WOngM2De Clercq E Anti-HIV drugs :25compounds approved wi

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