鼻咽癌放疗后化疗敏感性的变化

1、鼻咽癌放疗后化疗敏感性的变化【关键词】 鼻咽肿瘤；肿瘤细胞,培养的；基因,mdr1；P-糖蛋白；放射治疗；化疗敏感性摘要 目的 检测鼻咽癌CNE1细胞X射线照射前后多药耐药基因（mdr1基因）及其编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是否表达，以及化疗药物敏感性的变化。方法 利用RT-PCR、Western blotting和流式细胞仪（FCM）检测CNE1细胞X射线照射前后的mdr1基因和P-gp的表达及对柔红霉素（daunorubicin,DNR）的外排功能。结果 鼻咽癌CNE1细胞射线照射前mdr1基因、P-gp不表达；射线照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均长时

2、间表达。CNE1细胞射线照射后对DNR的蓄积作用略有降低。结论 鼻咽癌CNE1细胞X射线照射后化疗敏感性降低。 关键词 鼻咽肿瘤；肿瘤细胞，培养的；基因，mdr1；P-糖蛋白；放射治疗；化疗敏感性 The change of chemotherapy sensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell after radiotherapyAbstract Objective To examine the expression of multidrug resistance gene(mdr1) and P-glycoprotein(P-gp) in nas

3、opharyngeal carcinoma(NPC) CNE1 cell before and after radiotherapy,as well as the changes of chemotherapy sensitivity.Methods The expression of mdr1 gene and its protein P-gp was assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting.Flow cytometry (FCM) was perform

4、ed to examine the function of cell efflux to daunorubicin.Results Expression of mdr1-mRNA and P-gp of CNE1 cell in long time after radiotherapy was found,but not before.Intracellular daunorubicin(DNR) accumulation of CNE1 cell decreased after radiotherapy.Conclusion Irradiation decreases the chemoth

5、erapy sensitivity of CNE1 cell.Key words nasopharyngeal carcinoma;tumor cells,cultured;Genes mdr1;P-glycoprotein;radiotherapy;chemotherapy sensitivity 中晚期鼻咽癌的治疗原则为放疗、化疗综合治疗。按照化疗安排在放疗前、放疗同时和放疗后分为：诱导化疗、同步化疗和辅助化疗，目前上述各种匹配方法临床上都有应用。以前往往着眼于化疗后的MDR，但在射线照射后mdr1及P-gp的表达和功能尤其在鼻咽癌细胞及其基础研究较少。多药耐药基因（mdr1基因）扩增及其

6、编码产物P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的过度表达是目前已发现的最重要的一种多药耐药（multidrug resistance，MDR）机制，大多数肿瘤MDR的发生被认为与mdr1有关。我们所说的MDR一般是指由化疗引起的，但放疗是否会引起MDR呢？本研究观察体外培养的鼻咽癌CNE1细胞X线照射前后mdr1基因和P-gp的表达和功能的变化。1 材料与方法1.2 细胞培养 用含10%小牛血清及1%双抗的RPMI1640培养基常规37.0 、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰酶消化、传代。射线照射后继续培养两周后，每隔4天消化一次细胞冻存用于RT-PCR检测和Western

7、blotting分析。1.3 射线照射 取指数生长期细胞进行射线照射。照射源：美国VARIAN 2300 C/D型双光子直线加速器；照射条件：应用X射线，剂量率200 cGy/min,照射剂量：4 Gy;照射野大小：15 cm15 cm。照射前有物理室测量照射剂量率，并对培养皿进行衰减校正。把培养皿置于照射野中心。1.4 RT-PCR检测 参照文献1方法。1.5 Western blotting分析 亦参照文献1方法。1.6 流式细胞仪检测 待细胞长满单层用于流式细胞仪检测：（1）取未经X射线照射的CNE1细胞作为阴性对照，以排除细胞自身发光；（2）分取未经X射线照射、经X射线照射4Gy后经2

8、次传代的CNE1细胞，加入可自发红色荧光的柔红霉素2,使培养基中柔红霉素终浓度达2 mol/L。经X射线照射，加入柔红霉素的CNE1细胞，作为阳性对照（3）2 h后0.25%胰酶消化收获细胞，冷PBS(0 )吹洗、离心3次后，用500 l冷PBS吹散细胞；（4）在流式细胞仪上检测（激发光源波长488 nm,滤过光源波长575 nm）。每个标本检测的细胞数超过10000个。2 结果2.1 RT-PCR结果 CNE1细胞X射线照射前均未观察到mdr1 mRNA的表达；X射线照射后mdr1 mRNA均长时间稳定表达（见图1）。2.2 Western blotting 结果 CNE1细胞X射线照射前均

9、未观察到P-gp的表达； X射线照射后P-gp基本上均长时间明显表达（见图2）。2.3 FCM结果 FCM检测到：射线照射后CNE1的阳性细胞数不变，但细胞内的DNR平均荧光度略有降低。说明：CNE1细胞射线照射后对DNR的敏感性略有降低（见图3、4）。1:射线照射前的CNE1细胞;6:DNA Marker;25,710:射线照射后每4天的CNE1细胞图1图2 略3 讨论 多药耐药是肿瘤化疗失败的主要原因之一，是指肿瘤细胞先天存在或经化疗药物治疗后，表现出不仅对所用化疗药物产生耐药性，而且对许多结构无关和作用机制完全不同的其他抗癌药物产生耐药性。1976年Juliano与Ling首先观察到具有

10、MDR 表型的CHO细胞内药物积聚发生障碍,分子量为170 kD 的膜糖蛋白-P糖蛋白过度表达。该细胞摄入药物与敏感细胞没有差异，但药物外排能力却加强，表明P-gp能调节细胞膜通透性,影响药物在细胞内积聚3随后一系列研究证明MDR细胞抗药程度及胞内药物积聚与P-gp过度表达有关4，5 。P-gp是由mdr1基因编码、由1280个氨基酸残基组成、分子量为170 kD的跨膜蛋白。在肿瘤细胞中，图3 图4 略P-gp通过ATP供能，将长春新碱、秋水仙素、放线菌素D等药物泵出细胞外导致肿瘤细胞耐药。现已证实编码人P-gp的基因（mdr1）位于第7号染色体7q21，含28个外显子，全长为4.5 Kb。

11、中晚期鼻咽癌的治疗一般采取放疗、化疗综合治疗的原则。按照化疗安排在放疗前、放疗同时和放疗后分为：诱导化疗、同步化疗和辅助化疗，目前上述各种匹配方法临床上都有应用。以前往往着眼于化疗后的MDR，但在射线照射后mdr1及P-gp的表达尤其在鼻咽癌细胞及其基础研究较少。在其他肿瘤方面，Nielsen D等7报道：鼠Ehrlich腹水肿瘤细胞(EHR2)体外分次照射后获得MDR 表型， P-gp表达水平升高6。Osmak M等报道：人宫颈癌细胞（HeLa）射线照射后对长春新碱抵抗，并认为与P-gp有关。Hill BT等8用中国仓鼠卵巢肿瘤细胞(CHO)、 人卵巢癌细胞经X线照射均获得MDR 表型，P-

12、gp过度表达。来自临床的研究也报道放疗后残存的口腔癌组织P-gp表达明显上调9。 放射线是否可诱发多药耐药，目前结论尚不一致。Hill、Mattern、Thacker10，11等的实验研究支持分次或单次放射可增强mdr1mRNA的表达，提示可诱发多药耐药倾向。但Sanchez等12采用2Gy7次和2Gy14次的照射方式，可降低耐药基因的表达，提高对化疗药物的敏感性。虽然在耐药细胞系中，有mdr1基因扩增，但大多数研究认为，人体内P-gp的高表达并不是mdr1基因扩增的结果，而是mdr1基因转录翻译的产物13。因此，研究MDR多在mRNA和蛋白质水平，本实验应用敏感性高的RT-PCR与Weste

13、rn blotting方法检测到鼻咽高分化鳞癌细胞CNE1射线照射后较长时间内mdr1基因、P-gp均明显表达，提示射线照射后鼻咽癌细胞可能产生多药耐药倾向。当然，在体内的实际情况都需进一步验证。参考文献2 平宝红,周淑芸,刘启发,等.4种细胞因子对K56/S及其耐药细胞株K562/A02积蓄柔红霉素的影响.第一军医大学学报,2000,20(2):158-160.3 Juliano RL，Ling V.A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants.Biochem

14、 Biophys Acta,1976,455(1):152-162.4 Lehne G,Elonen E,Baekelandt M,et al.Challenging drug resistance in cancer therapy.Acta Oncol,1998,37(5):431-439.6 Nielsen D,Maare C,Eriksen J,et al.Expression of P-glycoprotein and multidrug resistance associated protein in Ehrlich ascites tumor cells after fracti

15、onated irradiation.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2001,51(4):1050-1057.7 Osmak M,Miljanic S,Kapitanovic S.Low doses of gamma-rays can induce the expression of mdr gene.Mutat Res,1994,324(1-2):35-41.8 Hill BT,Moran E,Etievant C,et al.Low-dose twice-daily fractionated X-irradiation of ovarian tumor cell

16、s in vitro generates drug-resistant cellsoverexpressing two multidrug resistance-associated proteins,P-glycoproteinand MRP1.Anticancer-Drugs,2000,11(3):193-200.9 Ng IO,Lam KY,Ng M,et al.Expression of P-glycoprotein, a multidrug-resistance gene product, is inducedby radiotherapy in patients with oral

17、 squamous cell carcinoma.Cancer,1998,83(5):851-857.10 Hill BT,Deuchars K,Hosking LK,et al.Overexpression of P-glycoprotein in mammalian tumor cell lines after fractionated X irradiation in vitro.J Natl Cancer Inst,1990,82:607-612.11 Mattern J,Efferth T,Volm M.Overexpression of P-glycoprotein in human lung carcinoma xenografts after fractionated irradiation in vivo.Radiat Res,1991,127(3):335-338.12 Sanchez AM,Barrett JT,Schoenlein PV.Fractionated ionizing radiation accelerates l