表皮生长因子对晶体上皮细胞增殖影响的研究

1、表皮生长因子对晶体上皮细胞增殖影响的研究【摘要】目的评价表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 对晶体上皮细胞增殖的影响。方法在培养的牛和人晶体上皮细胞中添加EGF,甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法测定细胞增殖情况以及抗EGF受体(EGF receptor, EGFR)抗体对EGF作用的影响。结果EGF浓度为10-1102 g/L对牛眼晶体上皮细胞增殖有促进作用，其中浓度为10 g/L作用3天达到最大促增殖效果；EGF浓度为1102 g/L 对人晶体上皮细胞增殖有促进作用，浓度为102 g/L具有最大促增殖效

2、果。抗EGFR抗体浓度0.5 mg/L时特异性阻断EGF对人晶体上皮细胞增殖的促进作用，浓度为3 mg/L时阻断率达81。结论EGF可促进晶体上皮细胞增殖，并提示人晶体上皮细胞表面存在特异性 EGFR，EGF与其受体结合后可促进细胞增殖，对白内障术后后囊混浊的发生发挥作用。【关键词】晶体上皮细胞生长因子Effect of epidermal growth factor on proliferation of lens epithelial cellsWANG Juan, LI Xiaorong, ZHANG Xiaohong, et al. International Intraocular

3、Implant Training Center, Tianjin Medical University, Tianjin 300070【Abstract】ObjectiveTo study the effect of epidermal growth factor (EGF) on lens epithelial cells (LECs). MethodsBovine LECs (bLECS) and human LECs (hLECs) in culture were treated with EGF. Then, MTT assay was used to examine the prol

4、iferation of the cells and the effect of anti-EGF receptor (EGFR) antibody. ResultsBLECs showed marked proliferation depending on the concentration of EGF from 10-1102 g/L, and EGF at a concentration of 10 g/L on day 3 induced the highest increase of proliferation; EGF promoted proliferation of hLEC

5、s at the concentration of 1102 g/L and EGF of 102 g/L showed the highest promotive effect on proliferation. The anti-EGFR antibody blocked the promotive effect of EGF on proliferation of hLECs when the concentration of this antibody was as low as 0.5 mg/L, and the blocking rate was 81% at the concen

6、tration of 3 mg/L. ConclusionsEGF has a promotive effect on proliferation of LECs. It is suggested that there are specific EGFRs on the surface of hLECs. EGFs bound to their receptors stimulate proliferation of LECs and play an important role in occurrence and development of posterior capsular opaci

7、fication after cataract surgery.【Key words】LensEpithelial cellsGrowth factor后囊混浊是白内障囊外摘除术后影响视功能的主要并发症之一，其发生与残留的晶体上皮细胞增殖有关1。研究影响晶体上皮细胞增殖的因素对于深入探讨后囊混浊的发病机制及防治有重要意义。我们在体外培养牛和人晶体上皮细胞的基础上，观察表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 对晶体上皮细胞增殖的促进作用，并通过抗EGF受体（EGF receptor,EGFR)抗体阻断EGF的促细胞增殖作用阐明其作用机制。材料与方法一、牛和人晶体上

8、皮细胞培养采用新鲜牛眼，清除眼球周围组织，消毒后于无菌条件下分离晶体前囊膜，加入含10胎牛血清的 DMEM培养液，吹打囊膜使细胞簇散落。将培养皿置于37、5CO2孵箱中，培养1周后，3或4天更换1次培养液。细胞生长发生融合时，用0.2胰蛋白酶溶液消化后传代培养。人晶体上皮细胞的原代培养来自白内障术中环形撕囊取出的晶体前囊膜，患者为先天性白内障，年龄520岁，性别及眼别随机。培养液为含20胎牛血清的DMEM培养液，避免吹打囊膜，培养条件及传代方法同牛眼晶体上皮细胞。二、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)测定法100 l细胞悬液接种于96孔培养板中

9、培养至所需时间后，加入10 l MTT试剂（终浓度为0.5 g/L），培养4 h(37)，加入100 l二甲基亚砜溶液，室温下静置5 min，采用酶标仪490 nm波长比色测定。吸光度(A)值与活细胞数成正相关。三、EGF对牛眼晶体上皮细胞增殖的作用取第2代已融合的牛眼晶体上皮细胞，以无血清DMEM培养液制成细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 l,细胞浓度为5107个/L。加入EGF，使其终浓度分别为10-2、10-1、1、10、102 g/L。培养后第3天 MTT法测定不同浓度EGF对细胞增殖的影响。选择促进牛眼晶体上皮细胞增殖作用最强的EGF浓度，于培养后第15天分别测定细胞增殖情

10、况。四、EGF对人晶体上皮细胞增殖的作用方法同牛眼晶体上皮细胞。96孔培养板每孔加细胞悬液100 l，浓度为1107个/L，含5%胎牛血清，EGF终浓度分别为10-1、1、10、102、103 g/L。培养后第3天MTT法测定细胞增殖情况。五、抗EGFR抗体阻断EGF对人晶体上皮细胞增殖的作用人晶体上皮细胞悬液100 l加于96孔培养板，浓度为1107个/L，含5%胎牛血清，并加入抗EGFR抗体，使其终浓度分别为0.1、0.5、1、2、3 mg/L。然后置于5% CO2孵箱37下预孵育30 min，加入EGF，浓度为促进人晶体上皮细胞增殖作用最强的浓度。培养后第3天MTT法测定细胞增殖情况。六

11、、统计学方法每份标本平行测定3个孔，求其平均值(s)，各组间比较采用t检验。结果一、牛和人晶体上皮细胞培养牛眼晶体上皮细胞原代培养后24 h囊膜片贴附于皿底，散在细胞簇也已贴壁，48 h细胞单层贴壁生长。细胞呈扁平的不规则多边形，胞质透明，核为圆形、色暗。细胞增长至1或2周时融合传代（1，2）。人晶体上皮细胞原代培养后4872 h囊膜片贴附于皿底。与牛眼晶体上皮细胞比较，细胞生长缓慢，胞体较小，胞质更为透明，细胞核较不明显（3，4）。二、EGF对晶体上皮细胞增殖的作用1.EGF浓度为10-1102 g/L对牛眼晶体上皮细胞的增殖有促进作用(P0.05)，其中浓度为10 g/L作用3天达到最大促

12、增殖效果。不同浓度EGF的增殖促进效果(添加因子组/未添加因子组)100。EGF作用不同时间的增殖促进效果（添加因子组/培养后第1天未添加因子组）100。其中培养后第1天未添加因子组A值为 0.2800.010（表1，2)。表1不同浓度EGF对牛眼晶体上皮细胞增殖的作用EGF浓度(g/L)吸光度值(s)增殖促进效果(%)t值00.2230.01910-20.2740.0211182.50810-10.3170.036*1363.57410.5350.018*23019.987100.6060.023*26021.6581020.4310.026*18510.651*P0.05*P0.001 表

13、2EGF作用不同时间对牛眼晶体上皮细胞增殖的影响EGF作用 时间(d)吸光度值(s)增殖促进效果(%)t值10.2890.0141030.90620.5140.031*18412.44430.6120.020*21925.72240.3460.029*1243.72750.3100.011*1113.497*P0.001*P0.05 2.EGF浓度为1102 g/L对人晶体上皮细胞增殖有促进作用(P0.01)，浓度为102 g/L具有最大促增殖效果。增殖促进效果（添加因子组/未添加因子组）100（表3）。表3不同浓度EGF对人晶体上皮细胞增殖的作用EGF浓度(g/L)吸光度值(s)增殖促进效果

14、(%)t值00.0460.01210-10.0630.0131371.66510.1000.007*2176.734100.1070.010*2336.7651020.1190.016*2596.3231030.0360.009781.155*P0.5 mg/L时有效(P0.05)，浓度为3 mg/L时阻断率达81。阻断率（添加因子未被抗体封闭组-添加因子抗体封闭组）/（添加因子未被抗体封闭组-未添加因子未被抗体封闭组）100。其中未添加因子未被抗体封闭组的A值为0.0640.012（表4）。表4抗EGFR抗体对mEGF促细胞增殖作用的阻断抗EGFR抗体浓度(mg/L)吸光度值(s)对EGF作

15、用的阻断率(%)t值00.1480.0110.10.1410.01380.7120.50.1150.009*394.02310.1020.015*554.28420.0850.008*758.02730.0800.010*817.926*P0.05*P0.5 mg/L时特异性阻断EGF的作用，浓度为3 mg/L时阻断率达81%。从而间接证实了人晶体上皮细胞表面存在特异性EGFR，EGF与其受体结合后发挥促细胞增殖作用。生长因子与经典的多肽激素不同，一般不通过内分泌方式，而主要通过旁分泌或自分泌的方式起作用。因此我们推断白内障囊外摘除术中，由于注吸皮质等机械性操作，造成晶体上皮细胞的损伤，术后残

16、留的晶体上皮细胞即引起损伤修复过程，合成释放EGF，其释放可能是修复过程中动员生长因子的一种快速途径。释放的EGF 及晶体中存在的EGF 与晶体上皮细胞表面特异性EGFR结合，促进晶体上皮细胞的增殖、移行和分化，并可能成为后囊混浊的原因之一。由此可以设想，以抗EGFR 抗体阻断EGF的促细胞增殖作用，在一定程度上可以抑制白内障术后后囊混浊的发生。作者单位：300070 天津医科大学世界人工晶体中国天津培训中心王娟（研究生，现在天津眼科医院，300020）参考文献1McDonnell PJ, Zarbin MA, Green WR. Posterior capsule opacification

17、 in pseudophakic eyes. Ophthalmology,1983,90:1548-1553.2Mayer U. Untersuchungen zur Atmug an ?berlebendem Linsenepithel. Ber Dtsch Ophthalmol Ges Heidelberg,1969,70:359-361.3Reddy VN, Lin LR, Giblin FJ, et al. The efficacy of aldose reductase inhibitors on polyol accumulation in human lens and retin

18、al pigment epithelium in tissue culture.J Ocul Pharmacol,1992,8:43-52.4Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods, 1983, 65:55-63.5Tripathi RC, Borisuth NSC, Tripathi BJ, et al. Radioimmunoassay of epidermal growth factor in human lenses at various stages of development of cataract.Exp Eye R