耳针对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞凋亡的干预研究

1、耳针对血管性痴呆大鼠海马神经元细胞凋亡的干预研究 吕杭州,王春庆,吕明庄,胡文清作者单位：054000 河北省邢台市，邢台矿业集团总医院康复科(吕杭州);贵阳医学院附属医院针灸科(王春庆、吕明庄);河北医科大学第三医院康复科(胡文清)【摘要】目的 观察耳针对血管性痴呆(VD)大鼠记忆力、海马神经元细胞凋亡及凋亡蛋白酶caspase3 mRNA表达的影响，探讨耳针治疗VD的可能机制。方法 采用4血管阻断方法制备VD大鼠模型,针刺脑、肾耳穴后,morris迷宫检测大鼠学习记忆能力改善情况、原位末端标记法观察海马CA1区神经元细胞凋亡数、原位分子杂交观察促凋亡蛋白酶caspase3 mRNA表达的变

2、化。结果 治疗组海马CA1区神经元细胞凋亡数明显减少(P0.01)，caspase3 mRNA表达降低(P0.01),and the expression of caspase3 mRNA was reduced too,which was negatively correlated with learning and memory abilities in the rats. Conclusion Auricular acupuncture can improve the disorder of learning and memory abilities in rats with VD,an

3、d its action mechanism may be that acupuncture could downregulate the expression of caspase3 mRNA, inhibit the neuronal apoptosis, protect the hippocampus neuron after cerebral ischemia.【Key words】 auricular acupuncture; dementia,vascular; cell apoptosis; acupuncture therapy; hippocampus血管性痴呆(vascul

4、ar dementia,VD)是指脑血管障碍所致，以痴呆为主要临床表现的疾病。本实验选用改良的4血管阻断(4vesselocclusion,4VO)制备VD大鼠模型,观察耳针对海马神经元细胞凋亡及促凋亡蛋白酶表达的影响，探讨耳针治疗VD的可能机制。1 材料与方法1.1 实验动物 健康Wistar大鼠32只，雌雄各半，双耳无缺损，34月龄，体重200250 g,由贵阳医学院实验动物中心提供。动物房室温1518，湿度70%左右，相同光照条件喂养，自由摄取大鼠标准饲料，饮用干净自来水。适应性喂养1周后开始试验。1.2 试剂与仪器 morris迷宫(中国中医研究院)细胞凋亡检测试剂盒、caspase3

5、 mRNA原位杂交检测试剂盒(均购自武汉博士德生物工程有限公司)。1.3 方法VO方法制作拟血管性痴呆动物模型。用10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，背侧正中切口暴露第一颈椎横突侧翼小孔，电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞。然后颈前部切口找到双侧颈总动脉，穿线备用，在大鼠清醒状态下用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min，共3次，每次间隔1 h，然后缝合，常规饲养。模型成功的标志：术中四血管完全离断后1 min可见大鼠翻正反射消失，大鼠虹膜在缺血后几秒中变苍白色，再灌注后以上情况恢复正常。术后morris迷宫检测发现大鼠学习记忆能力明显下降。术后10 d病理切片可见明显缺血

6、缺氧和海马神经元细胞损伤表现：脑组织明显水肿;散在脑梗死灶;典型的噬细胞现象;神经元细胞核固缩、核仁消失等。3 mRNA检测:采用原位杂交间接法，石蜡切片脱蜡至水;滴加30%H2O2，室温10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗涤;滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37消化30 min 以暴露mRNA片段;原位杂交用PBS 洗涤;每张切片加预杂交液20 l置入湿盒，恒温箱42,4 h，不洗;每张切片加杂交液20 l置入湿盒，恒温箱42 过夜(16 h);2SSC 37水温5 min2次。滴加封闭液37，30 min;甩去多余液体，不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛37，60 min;原位杂交用PBS 洗

7、涤;滴加SABC 37，20 min;原位杂交用PBS 洗涤; 滴加生物素化过氧化物酶37，20 min;原位杂交用PBS 洗涤;DAB显色10 min;充分水洗，苏木素复染、脱水、透明、封片。1.4 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以s表示，各组间比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVE )和q检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 学习记忆能力测试结果 模型组找到平台时间与术前及对照组比较差异有统计学意义(P0.01),耳针治疗组找到平台时间与模型组比较差异有统计学意义(P0.01)。见表1。2.2 3组神经元细胞凋亡数比较 以阳性细胞数表示缺血神经

8、元损伤程度。模型组TUNEL标记阳性细胞数与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);耳针治疗组TUNEL标记阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P0.01)。见表2。2.3 3组caspase3 mRNA表达阳性细胞数比较 caspase3 mRNA表达阳性细胞计数，模型组caspase3原位杂交细胞阳性数与对照组比较明显增加(P0.01);耳针治疗组caspase3原位杂交阳性细胞数与模型组比较差异有统计学意义(P0.01)。见表2。表1 3组大鼠morris迷宫学习记忆成绩比较表2 3组神经元细胞凋亡数、caspase3 mRNA表达注：与对照组比较，*P0.05，#P0.01;与模

9、型组比较，P0.013 讨论内经云“耳者，宗脉之所聚也。”耳与经络系统及全身脏腑器官有密切联系，针刺耳穴可治疗多种疾病。耳穴肾可益肾填精、壮骨补髓,耳穴脑可以健脑益智，通脑络。本实验选用耳穴肾、脑治疗VD大鼠，行为学测试结果显示，针刺耳穴肾、脑明显改善VD大鼠学习记忆障碍。Macmanns等1首先报道大鼠脑缺血后海马CAI区、纹状体出现DNA梯状片断，并通过终末标志技术定量发现DNA损伤程度与缺血程度成正比关系。证明全脑缺血后细胞死亡机制既有坏死也有凋亡。脑缺血可引起凋亡，其凋亡细胞多少、发生部位与缺血时间、程度及神经元敏感性有关2。细胞凋亡是受基因调控的程序性死亡，caspase家族是一大类

10、凋亡调节基因,与线虫的死亡基因CED3同源,是哺乳动物细胞凋亡的启动和执行者3。其中caspase3与CED3同源性最高，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用。在蛋白酶级联切割过程中，caspase3处于核心位置,不同的蛋白酶分别切割caspase3酶原,从而激活caspase3;活化的caspase3又进一步切割不同的底物,导致蛋白酶级联切割放大,最终使细胞走向死亡4，5。抑制 caspase3激活表达，就可以减轻由它介导的缺血性神经元损害。本实验结果显示，VD模型大鼠大脑切片经检测，发现海马CA1区出现大量神经元细胞凋亡，同时caspase3 mRNA高表达。证实反复的缺血再灌注和长期

11、的低灌注状态可导致功能神经元发生继发性损害细胞凋亡，海马是敏感易受损区，智能损害是神经元损害的结果。脑缺血发生后，caspase3在凋亡的事件中耳针治疗组海马CA1区神经原细胞凋亡数明显减少，caspase3 mRNA表达下调，学习记忆障碍明显改善，与模型组比较差异有统计学意义。提示耳针改善VD大鼠的学习记忆能力障碍的可能机制是，耳针抑制caspase3 mRNA的表达，中断由蛋白酶介导的细胞凋亡过程，减少神经元细胞凋亡，保护缺血受损的神经元细胞，最终起到治疗VD的作用。【参考文献】1 Macmanus JP,Hill IE,Huang ZG,et al.DNA damage consiste