肠毒素性大肠杆菌疫苗研究现状.docx

1、【综述】肠毒素性大肠杆菌疫苗研究现状徐兴福，毕建萍，金以森关键词)肠毒素性大肠杆菌；定居因子抗原；肠毒素;肠毒素性大肠杆菌(entertoxigenicescherichiacoll,ETEC)是婴幼儿腹泻的主要病原菌。Wenneras等估计每年全球5岁以下儿童因ETEC感染的病例高达2亿人次，ETEC也是到发展中国家旅游者腹泻的主要病原菌，30%-60%的旅游者腹泻由ETEC所致。一般认为ETEC属非侵袭菌，进入宿主体内后，由定居因子(colonizationfactor,CFs)黏附到小肠上皮细胞表面，产生热敏肠毒素(heat-labiletoxin,LT)和/或耐热性肠毒素(heat-s

2、tabletoxin,ST),影响宿主肠道细胞对电解质和水的吸收和分泌功能，造成分泌性腹泻。报道过的CFs超过22种，呈地域差异，常见定居因子抗原I(colonizationfactorantigen,CFA)和菌毛表面抗原(colisurface,CS)CS1CS7、CS14、CS17、CS21。到目前为止，ETEC疫苗主要针对CFs和LT而构建。1全菌体灭活疫苗瑞典哥德堡大学开发的口服灭活ETEC疫苗VTB-CFETEC,由5株产生不同定居因子的ETEC笛株(表达CFA/I、CS1-CS5)与霍乱毒素B亚单位(iCTB)组成。除了增加埃及6-18个月的婴幼儿的呕吐次数，瑞典、孟加拉国、埃及

3、成人志愿者试验证明该疫苗有良好耐受性和免疫原性，孟加拉国、埃及儿童临床试验也得到相似的结果。Qadri等研究认为减少每次服苗量、增加服苗次数有助于解决呕吐这一副作用问题。遗憾的是，迄今为止.惟一的婴幼儿保护率研究显示：对埃及6-18个月的婴幼儿保护率仅为20%,不能预防ETEC腹泻。可能该疫苗缺少流行区关键定居因子抗原或该人群免疫应答能力较弱。有研究认为肠道微生物的过度增长与敬虽元素的缺失可能减弱机体免疫应答的能力由于研究人数不足，疫苗rCTB-CFETEC对成人旅游者腹泻保护率的研究难以得出令人信服的结论o672名去墨西哥和危地马拉的美国旅游者随机、安慰剂对照的前瞻性研究中,疫苗可预防的结局

4、(vaccinepreventableoutcome,VPO)为ETEC腹泻，其定义要求：排除其他病原曲原因，腹泻病人粪便培养出ETEC表达的抗原与疫苗中所含抗原相同。尽管亚组分析对轻度ETEC腹泻无明显预防作用，但可明显减少重度ETEC腹泻(影响旅游行程或日稀便次数25次)的发生(PE=77%,P=0.039)o鉴于rCFB-CFETEC免疫保护时间仅约3个月等，James认为疫苗iTB-CFETEC预防旅游者腹泻价值有限，建议用于ETEC在高流行区短期旅游旦年作者单位：杭州市萧山区疾病预防控制中心，浙江311201疫苗龄在2岁以上的旅游者。该疫苗需根据流行区流行株特征增减相应抗原，以及采用

5、佐剂、改进呈送系统等方法来提高疫苗的免疫效果。2减毒活菌苗ETEC自然突变株E1392-75-2A,失去ST、LT表达能力,仅有CFA/U(CS1、CS2、CS3)活性。志愿者攻击试验显示：对同源ETEC的保护率为75%,15%受试者出现中度腹泻。研究者借签沙门菌减毒途径，对其染色体定点突变,构建了重组突变株：PTL001(AaroC.htrA)、PTL002(ompR、aroC)和PTL003(AaroCompC、ompF)。在双自-、安慰剂对照研究中，PTL002、PTL003口服免疫人体后，PTL003组31人中仅2人发生轻度腹泻，PTL003比PTL002呈现更持久的肠道定居能力和更强

6、的免疫原性，提示PTL003比PTL002更值得进一步试验以检测其保护率。利用ETEC菌株WS-1858B,Turner等“°)构建了疫苗株ACAM2010(aroC、ZiompC、AompF)，在I期临床试验中，未发现严重副反应，疫苗组CFA/IIgA和IgG抗体阳性率(73%)显著高于对照组(44%)。Daley等)所作的研究中，全胃肠灌洗液检测发现ACAM2010可诱发黏膜免疫反应，且共有剂址-反应关系。3载体疫苗ETEC疫苗载体菌多为雹乱弧菌、刑疾杆留、伤寒杆菌等肠道病原菌。很乱与ETEC腹泻在致病萌、致病机理、免疫学上相似以及霍乱肠毒素亚单位CTB与LT亚单位LTB高度同源

7、，因此Favg等S构建了以霍乱减毒活疫苗CVD103-HgR为载体的ETEC疫苗，成功表达CFA/I、CS3、CS6抗原。美国马里兰州立大学疫苗研发中心(CVD)研发了2a型福氏痢疾杆菌菌苗CVD1208(pCFA/I-CS3)、宋氏痢疾杆菌菌苗CVD1233(pCS4-LThK63)及I型志贺痢疾杆菌苗苗CVD1252(PCS2)O豚鼠实验显示(，接种上述3种曲株混合物的豚鼠能产生针对相应的载体、5种ETEC抗原的血清和黏膜抗体。Sercny实验发现80%(8/10)接种2种或3种菌株混合物的豚鼠能抵御同型痢疾杆菌的攻击。CVD的目标是研制出5株表达大部分关键的CFs和LT的痢疾杆菌载体疫苗

8、，同时预防细菌性痢疾和ETEC腹泻。郑继平等)用福氏痢疾杆菌载体疫苗FE3(pCS3、pLTB/STm)、FE16(pCFA/I、pCS6)同等剂虽相混合，口服免疫小鼠，能够诱导机体产生相应的抗ETEC特异的血清和黏膜抗原抗体反应，达到了与各单独疫苗株一致的免疫效果，同时保持了载体菌自身的免疫原性。Osorio等E将甲醛灭活的CVDI203(pCFA/I-CS3)口服或鼻饲免疫小鼠，均产生抗CFA/I、CS3IgG抗体。研究提示发展ETEC菌蜕疫苗递呈ETEC抗原的可能。菌蜕是通过PhiX174噬菌体溶菌基因E的可调控表达而形成的、缺少细胞浆和核酸且无繁殖能力的革兰阴性细菌菌体，可作为疫苗的呈

9、送系统。与物理化学灭活菌苗相比，菌蜕疫苗不含细胞内含物而更安全；内外膜结构保持良好，易于在特定组织和细胞中黏附，增加了抗原提呈细胞的提呈机会。在2a型福氏痢疾杆菌疫苗抹SC602(ZSicsA、AiucA)基础上，美国WalterReed陆军研究院(WRA1R)研发了毒性更低的宋氏、2a型福氏二价埔疾杆菌SC608(AicsA,iucA、Aasd»pCFA/I)和SC608(icsA、AiucA asd、pCFA/1、pLTB)l，6研究显示，在保留痢疾杆菌侵袭性同时，免疫后豚鼠产生抗CfaB(CFA/I亚单位)、LTB黏膜和血清抗体，免受&型福氏野生株的攻击°与不

10、具备侵袭性菌苗相比，有侵袭性菌苗可能更少的剂址便足以提供保护作用。以减毒伤寒杆菌载体的ETEC疫苗已进入临床试验阶段,Microscience公司研发的菌株TSB7(Ty2aroC、AssaVssaG-、eltB)临床试验报道67%的志愿者诱导出针对LTB的免疫应答，无明显接种副反应，表明伤寒杆菌-ETEC抗原呈递系统值得进一步研究。4DNA疫苗为增强宿主对DNA疫苗的免疫应答能力，研究者对DNA疫苗的免疫方式、佐剂、载体等进行了广泛的试验。聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(DL-lactide-co-glycolide)PLGA安全无毒副作用，生物相容性良好，可降解吸收；其微球作为抗原缓释裁体，

11、能控制抗原释放速度，释放出的抗原穿过肠上皮细胞，经淋巴管和血管扩散全身，激发体液免疫和黏膜免疫。Byrd等比较CS3-PLGA、CS3、CS3+mLT(LT突变体)3组鼻饲小鼠后免疫应答差异，发现CS3PLCA组所诱导血清及黏膜IgC.IgA抗体反应明显强于CS3组，亦强于CS3+mLT组(差异无统计学意义)，但CS3+mLT组呈现明显的副作用，提示PLGA具有佐剂作用，能显著提高CS3免疫原性。lsaro等3)尝试用初始-加强免疫策略提高宿主免疫应答能力。DNA疫苗pRECFA、重组减毒鼠伤寒沙门菌HG3两者均表达CFA/I亚单位CfaB。与单一疫苗免疫相比，pREC-FA肌注后口服HG3加

12、强免疫小鼠，能提高抗CfaB血清IgG抗体及粪便】gA抗体的滴度，增强对野生株CFA/I黏附特性的抑制能力。pRECFA初始免疫、HG3加强免疫产生的母传抗体能有效保护幼鼠耐受野生株的攻击。经皮免疫足将抗原和/或佐剂局部作用于皮肤，从而诱导产生全身免疫反应的一种新方法。成人志愿者双盲、安慰剂对照研究中山)，志愿者分别在0、21和42d手臂皮肤斑贴50展LT或安慰剂。第56天，接受6x!08cfuLT+/ST+的ETEC菌株攻击。结果显示，经皮免疫LT激发特异性抗毒素免疫应答，不足以预防ETEC腹泻的发生但可减轻腹泻的严秉程度。值得注意的是：实验中志愿者接受的攻击剂员高于自然环境中感染剂量c若L

13、T的保护率得到现场实验的证实，可考虑在ETEC疫苗构建中加入佐剂LT05转基因植物疫苗转基因植物疫苗具有生物安全性高、能有效启动就膜免疫、生产成本低、储藏运输方便及直接口服等优点。抗原LT在烟草、玉米、西红柿、马铃薯、胡萝卜等植物已成功表达，部分转基因植物疫苗进入临床试验阶段121-24Taeket等报道S：9名志愿者口服2.1g转基因玉米(含1mgLTB),其中7名受试者血清抗LT好、抗体分泌细胞ASC显著增高，4名受试者的粪便中检测到IgA抗体。实验证明转基因植物ETEC疫苗对人体是安全的，具有一定的免疫原性，但仍有许多问题有待解决，如抗原蛋白表达址过低、口服耐受性等。综上所述，ETECC

14、Fs的种类多，存在地区性差异，导致疫苗研制困难。目前，ETEC疫苗中仅iTB-CFETEC在流行区开展了成人及婴幼儿现场保护效果研究，新近出现的藤蜕疫苗、DNA疫苗、转基因植物疫苗技术为疫苗的研制提供新的思路。参考文献1)WenncrasC,ErlingV.PrevalenceofcntertoxigenicEscherichiacoliassociateddiarriicaandcarrierstateinthedevelopingworldJHealthPopulNub,2004,22,370-382.2SteffenR,CastelliF,DieterNothdurftH,eta).Va

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