黄芪多糖和氧化苦参碱协同增强鸡新城疫疫苗免疫效果研究.docx

1、DOI:10.13207/j.ciiki.jnwafii.2015.06.028网络出版时间：2O15-O5.ll15:03磷崎谶版缚址期kcms/degg峰株葡技美孳孽抿(培禽滁串腆12015年6月JournalofNorthwestA安FUniversity(Nat.Sci.Ed.)黄茂多糖和氧化苦参碱协同增强鸡新城疫疫苗免疫效果研究陈茜】，邢玉娟2,陈玉库2,胡元亮，王德云。蔡丙严2(1南京农业大学动物医学院.江苏南京210095；2江苏农牧科技职业学院.江苏泰州225300)摘要【目的】研究黄斐多(Astragaluspolysaccharides.APS)和氧化苦参碱(Oxymalr

2、ine,OM)对新城疫疫苗免疫的影响。【方法】将M日龄非免疫罗曼蛋公鸡550羽随机均分为11组，19组分别为()AP(以OM与APS质量比为6«4配成)、()M和APS的高(4mg/mL)、中(2mg/mL)、低(Img/mL)剂虽组.10组为免疫对照组.11组为空白对照组。除空白对照组外.各组试验鸡只均于14日龄首免、DVIV系疫苗.28日龄而：复免疫。在首次免疫的同时.19组分别口服商、中、低剂量:药物.免疫对照组和空门对照组口服等鼠生理拙:水，每天1次.连续3d。分别于5和42日龄采血.用MTT法测定T淋巴细胞增殖的变化,用什微质法测定血清抗体效价变化。于1

3、4,21.28和35日龄.每组随机抽取鸡4羽.称体质揪.削杀.摘取法氏囊和脾脏并称质伉计算免疫器官指数。【结果】()AP、()M、APS高、中剂信隹各时间点均能促进T淋巴细胞增殖；()AP高、中剂技组在各时间点抗体效价显著高于免疫对照组：OAP高、中、低剂屈组在各时间点的脾指数和法氏囊指数均显著高于免疫对照组(CAP低剂所组35日龄除外【结论】黄芭多糖和氧化苦参碱能协同增强鸡新城疫疫苗的免疫效果。关键词中药成分复方；T淋巴细胞增殖；抗体效价；免疫器官指数中图分类号S853.7文献标志码A文章编号1671-9387(2015)06-0041-06Increasingimmuneefficacyo

4、fNewcastlediseasevaccineinchickenbyastragaluspolysaccharideandoxymatrineCHENXi收稿日期一2014-05-27WZuTTiHP4IxlWHr-irW4X4>ilPIf。八houAr>uF女-4-必爪/hl=奸*SArtfiM，。八io11八力八no、,XINGYu-juan2,CHENYu-ku2,HUYuan-liang1WANGDe-yun1,CAIBing-yan2(1CollegeofVeterinaryMedicineNanjingAgriculturalUniversity.NanjingJia

5、ngsu210095A'hina:2JiangsuAgrianimalIltislnindryV(Kational('ollegr,Taizhou.Jiangstt225300.C/jzwu)Abstract:IObjective)Thispaperaimedtostudytheimmuneeffectofastragaluspolysaccharide(APS)andoxymatrine(OM)onNewcastlediseasevaccine.MethodFivehundredandfifty14-day-oldnon-iminiinizedRomancockswerera

6、ndomlydividedinto11groups.GroupsIto9were()AP()MandAPSqualityratioof6:4)，OMandAPSathigh(4mg/mL).medium(2mg/mL)andlow(Img/mL)doses.respectively.Group10wasvaccinecontrolandgroupI1wasblankcontrol.GroupsIto10werevaccinatedwithNDV-1attheagesofI4and28days,respectively.Atthesametimeofthefirstvaccination.the

7、chickensingroupsIto9weregivencompoundsathigh.mediumandlowdosesandchickensinvaccinationandblankcontrolgroupsweregivenphysiologicalsalinebyoraladministration.onceadayforthreeclays.Ondays5and42.peripheralIlymphocyteproliferationsandserumantibodytitersweredeter-minedwithMT'Fmethodandp-micr

8、oscopicmethod.respectively.On14.21.28and35days.theorganindexesofspleenandbursaweredeterminedbykillingIchickensineachgroup.LResultJTlymphocyteproliferationswerepromotedby()AP()MandAPSathighandmediumdosesandserumantibodylitersof()APathighandmediumdosesweresignificantlyhigherthanthoseofvaccinecontrolgr

9、oup.Atanytime,spleenandbursaindexesof(JAPatallclosesweresignificantlyhigherthanthoseofvaccinecontrolgroup(excepttheOAFlowdosegroupfor35-dayoldchicken).ConclusionJAPSandC)McouldsynergisticallyimprovetheimmuneefficacyofNewcastlediseasevaccineinchicken.Keywonls：Chineseherbalmedicinalingredientscompound

10、s;Tlymphocyteproliferation：antibodytiter：immuneorganindex研究证明,中药及其主要成分作为-种免疫增强剂.具TF来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势.不仅能克服油乳类、铝胶类化学佐剂副作用大.局部刺激重、致癌、制备和使用麻烦或不足以提高弱抗原的免疫原性等弊病"而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能.促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌住勺。在前期研究中.笔者所在研究团队发现.黄注多糖（.Astragaluspolysaccharides.APS）与氧化苦参碱（OxymatrineOM）等中药成分具有显著抑制新城疫病毒（Newsa

11、stlediseasevirus.NDV）增殖的作用；中药成分复方在攻毒前、与攻毒同时和攻毒后给药均能显著降低受试鸡的死亡率,提高血清NDV抗体效价.减轻死亡妈的器官出血,但对于其增强免疫作用机理的研究尚未见报道。木试验在前期研究基础上.进-步测定了中药成分及其复方对新城疫苗免疫后雏鸡外周血T淋巴细胞增殖、血清抗体效价、法氏囊指数和脾指数的影响.进-步探讨中药成分复方增强免疫的作用机理，以期为研制中药成分免疫增强削提供理论依据。1材料与方法1.1材料I. 1.I药物准备根据以前的试验结果队.分别用双蒸水将OM、APS和OM-APS（OAP.以双M与APS质量比为6：4配成）配制成高（4mg/m

12、L）、中（2mg/mL）、低（1mg/mL）3种质量浓度的溶液.常规消毒后备用。1.1.2 疫苗和病毒新城疫1系（NewcastlediseasevirusIVstrain.NDV-1）疫苗.中牧股份南京药械厂生产,批号753-3。新城疫检测抗原.由南京农业大学动物医学院中兽医研究室提供。新城疫强胚.恒温培养72h.收获尿囊液.按Reed-Muench法测定鸡胚半数感染吊（Egginfectiousdose.EID5o）为10-8.七I.1.3主要试剂RPM1164O培养液.Gibco公司产品.按说明书用三蒸水配制后过滤除曲.分装.4（保存.临用前加入犊牛血清达体积分数5%.同时加青霉素、链霉

13、素各10（）lU/mL：植物血凝素（PHA）.上海伊华科技有限公司产品.用RPM11640培养液配制成0.1mg/niL.0.22“m微孔滤膜过滤除菌.分装后一20笆保存：四甲基偶氮哇蓝（MTT）溶液.Amresco公司产品,用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，使最终质缺浓度为5mg/mL.0.22微孔滤膜过滤除菌.分装后It冰箱避光保存；淋巴细胞分离液.上海恒信化学试剂有限公司产品；淋巴细胞裂解液二甲基亚碗（DMS。）.分析纯.苏州正兴化工研究院产品。1.1.4试验动物1日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡600羽.购自汤泉农垦种鸡场°试验期间采用笼养.全价伺料.自由采食和饮水.11

14、4日龄采用红外灯保温.全日制光照。1.2试验设计雏鸡饲养至14日龄（平均体质虽95g/只），平均母源抗体效价3.3时,随机选取550羽均分为II组。第19组为OAP高（OAPh）、OAP中（OAPm）、OAP低（OAPl）、（）M高（OMh）、（）M中（OMm）、OM低（）Ml）、APS高（APSh）、APS中（APSm）和APS低（APSl）.第10组为疫苗对照组,第II绢为空白对照叩隔离伺养。除空白对照叩外.共.他组试验鸡于II日龄西免.用NDV-N系疫苗滴鼻、点眼免疫.每羽I羽份；28日龄时重复免疫。在首次免疫的同时.3个1药复方组分别口服高、中、低剂量的OAP复方.母羽Iml,6个单味

15、药组分别连续3d。分别于14.21,28,35和42日龄.每绢随机取鸡4羽.无菌心脏采血（4.0mL/羽）.肝素抗凝测定外周血淋巴细胞增殖；每叩随机另取鸡10羽翼挣脉采血，分离血清.用伏微吊:法测定HI抗休效价。在14,21.28和35日龄.每组随机取鸡4羽.称体质虽，剖杀.摘取法氐囊和脾脏并称其质量.iI算免疫器官指数（免疫器官质量/体质量X100%）。1.3淋巴细胞增殖的测定采用MTT法口将抗凝血样用Hank's液稀释1倍.小心加在淋巴细胞分离液上层.2000r/min离心20min.吸取中间云雾状白细胞层.用无血清RPM11640培养液洗2遍.1500r/min离心15mine台

16、盼蓝染色.细胞计数活细胞大于90%后.用RPM1I64O培养液调整细胞密度为2.5X1（）6个/mL,加入到96孔细胞培养板（德国Nundcn公司生产）中，80/,/孔，每孔再加20“1.PHA.每个样品重夏4孑L.然后'置于39.5°C、体积分数5%CO2条件b（CO2培养箱.美国Revco公司产品）培养44h.然后每孔加入MTT溶液20继续培养4h后.每孔加裂解液100将细胞板置于微量振荡器（75-2A型.上海医用分析仪器厂牛产）上振荡5min使沉淀完全溶解在酶联免疫仪（DG-3022型.中国华东电子管厂生产）上于570nm处检测吸光值（A57。）作为丁淋巴细胞增殖的指标

17、。1.4抗体效价的测J定在96孔微量血凝板上.从左到右每孔各加5（）MPBS液.再向每排的第I孔加入50待检血清.依次向后倍比稀释宜至第12孔.然后向每孔加入50“L4单位抗原.在微量振荡器上振荡混匀后皆于温箱中感作20min。取出血凝板向每孔加入50鸡红细胞悬液.同时设阳性血清、阴性血清及空|'|对照孔，振荡混匀后置于37°C温箱中感作30min,待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果o1.5数据处理淋巴细胞值、HI效价和免疫器官指数以“平均值士标准差”表示。用SPSSII.0软件进行统计分析,比较各时间点淋巴细胞转化、抗体效价和免疫器官指数的差异性。2结果与分析IOM.ASP和

18、CAP对鸡淋巴细胞增殖的影响OM、ASP和OAP不同剂量和免疫对照叩各时间点A列值均显著高于空白对照m（P<0.05）；与免疫对照组相比较OAPh、（）.APm、（）Mh、OMm、APSh、APSm在各时间点.OAPl和APSl在21.28.35和42日龄,OMl在21,28和42日龄的A570值显著升高（表DoOAPh在各时间点心。值均显著高于（）Mh和APSh（PV0.05）：（）APm在28日龄人洒值高于APSm.但差异不显著.其余各时间点其A洌值均显著高于（）Mm和APSm（P<0.05）；不同剂妣复方组和OMh、APSh在21日龄.膏。值达到高峰.其余各单味药及对照组在2

19、8日龄达到高峰（表1）。表1()M、ASP和CAP高、中、低剂量对鸡淋巴细胞增殖的影响Table1InfluenceofOM.ASPandOAPathigh,mediumandlowdoesonTlymphocyteproliferation组别Group日畛dDayage1421283542CAPh0.342±O.O4Oa0.395±0.086a0.384±0.051a0.366士0.083a0.318±0.040aOAPm0.334士0.073a0.386±0.061a0.375士0.055ab0.352士0.047a0.3】2士0.049

20、aCAPl0.2】l士0.065de0.309±0.041be0.308士0.078c0.284±0.063b0.258士0.032beOMh0.240士0.022h0.343士0.087b0.3】2士0.041c0.282士0.059bO.254±O.048beOMm0.23l±0.028cd0.305±0.052be0.331±0.041c0.289±0.054b0.268士0.032bOMl0.208±0.044de0.284士0.066c0.304±0.042c0.262士0.042be0.234

21、±0.064cAPSh0.255士0.019be0.340±0.034b0.324士0.070c0.301±0.044b0.263±0.040beAPSm0.238士0.044bed0.331士0.091be0.340士0.042be0.291±0.029b0.275±0.048bAPSl0.209士0.034de0.296士0.047be0.306±0.055c0.273士0.048b0.251士0.036be免疫对照Vaccinationcontrol0.188士0.027e0.236士0.068d0.239士0.041

22、d0.224±0.093c0.171±0.024d空白对照Blankcontrol0.155士0.016f0.174士0.019e0.187士0.031e0.173士0.036d0.130士0.029e注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著（PV0.05）。下同。Note：Differentlowercaselettersineachcolumnindicatesignificantdifference(P<Z0.05).I'hesamebelow.2.2 ()M、ASP和OAP对鸡抗体效价的影响对照组(PV0.05)；()APh和OAPm在1442日士nk

23、fA-n,、"Ad、AZz51"IZz.21日龄抗休效价显著高于免疫对照ffl（P<0.05）oOAPh的抗休效价在各时间点均显著高于OMh和APSh（P<0.05）：（）APm抗休效价在21.28.35和42日龄显著高于（）Mm.在21.28和35日龄显著高于APSm（PV0.05）,OAPl抗体效价在28日龄显著高于C）Ml（P<0.05）（表2）。表2OM.ASP和（）AP高，中、低剂量对鸡血清抗体效价的影响Table2Influenceof()M.ASPandOAPathigh.mediumandlowdocsonserumantibodytite

24、r组别GroupOAPh()APm()APl()Mh()MmOMlAPShAPSmAPSl免技对照Vaccinationcontrol空白对照Blankcontro7士0.48a7.5士0.52a8.7士0.67a7.9±0.56a7.0±0.67a6.5士0.71ah7.2士0.42ab8.4士0.51a7.4士0.6.9a6.8士0.63ab5.6±0.69cd6.8士0.42be7.5±0.71be6.3±0.67be5.5±0.52de5.5±0.75d6.6±0.52c6.7&#

25、177;0.48e6.1±0.56bed5.5±0.72de6.0±0.70bed6.4±0.69c7.7±O.67b6.4±0.51be5.7±0.67d5.6±0.69cd6.2±0.79cd6.8士0.63de6.2±0.78bed5.6士0.51de6.0±0.66bed6.5士0.84c7.0士0.67cde6.6士0.69b6.1士0.73cd6;2±0.42abc6.6士0.5】c7.8+0.42b6.7±0.48b6.3士0.67be6.1±

26、;0.56abed6.7士0.67be7.4士0.84bed5.9±0.73cd5.6±0.51de5.6±0.70cd5.8士0.42d6.8士0.78de5.6±0.69d5.0±0.47e2.9士0.32c2.9士0.57e2.8士0.422.7±0.67e2.6±0.42f日岭/dDayage2.3 （）M、ASP和OAP对鸡免疫器官指数的影响2.3.I法氏囊指数的变化由表3可知.OAP-OMH、OMl、免疫对照组和空白对照叩的法氏囊指数在21日龄达到峰值,其他各组在28日龄达到峰值；各药物绢及免疫对照组法氏卷指数均

27、显著高于空白对照（FV（）.05）；OAPh、（）APm、OMm.OML、APSh、APSm、APSl在各时间点,OMH在21和28日龄及OAPl在14.21和28日龄法氏囊指数显著高于免疫对照组（P<0.05）o（）APh的法氏囊指数在各时间点均显著高于（）Mh.在28和35日龄显著高于APSh.（）APm的法氏囊指数在35日龄显著高于OMm和APSm（PV0.05）°表3（）M、ASP和CAP高，中、低剂量对鸡法氏it指数的影响Table3InfluenceofOM.ASPandOAPathigh,mediumandlowdoesonbursaindex%组别Group日龄

28、/dDayage14212835OAPh0.56士0.030a0.58士0.041a0.63士0.021a0.52±0.035aOAPm0.54±0.012ab0.55士0.037ab0.58士0.014b0.50士0.011abOAPl0.45±0.022d0.50±0.020cd0.48士0.024cd0.36±0.040d()Mh0.43±0.018de0.48士0.024d0.46±0.024d0.34±0.019dOMm0.52士0.037abc0.54±0.033alx-0.56±0

29、.028b0.46±0.038beOM,.0.50士0.035c0.54士0.015be0.51±0.029c0.44±0.017cAPSh0.53±0.024abc0.55士0.031abc0.57=0.009b0.47士0.031beAPSm0.54士0.035ab0.56士0.034abO.57±O.O11b0.45±0.042cAPSl0.51±0.026be0.53±O.025al)c0.57±0.036b0.44±0.022c免疫对照Vaccinationcontrol0.40士0.

30、013e0.43±0.024e0.42±0.036e0.33±0.020d空白对照Blankcontrol0.36±0.028f0.38±0.030f0.34士0.040(0.26士0.015e2.3.2脾指数的变化山表4可知.OAP各剂量组、0Mm、APSh、APSm在各时间点J）MH在14和35日龄、OMl和APSl在14.21和35日龄脾指数显著高于空白对照组<P<0.05）；OAP各剂量组、OMm.APSh、APSm在各时间点及OMl在21日龄和APSl在14和21日龄的脾指数均显著高于免疫对照组（PV0.05）。（）APh

31、在各时间点的脾指数均显著高于（）Mh；OAPm在21.28和35日龄的牌指数显著高于3讨论1中药成分复方及其组分药对淋巴细胞增殖的影响淋巳细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个章要指标细胞免疫是通过致敏淋巴细胞与相应抗原作用而发挥抗病原休感染、抗肿瘤、帮助B淋巴细胞产生抗休等作用。本试验结果表明.9个试验药物组中.除（）APl、（）Ml、APSl在II日龄，OAPh的效果最好。fflo提示（）AP、APS和OM在合适的剂量均能刺激淋巴细胞增殖.促进细胞免疫.且以OAPm、表4（）M、ASP和CAP高、中、低剂量对鸡脾指数的影响Table4InfluenceofOM.ASPandOAPathigh

32、.mediumandlowdoesonspleenindex%组别Group日龄/dDayage14212835OAPh0.19士0.017ab0.21±0.014ab0.22士0.015ab0.20士0.015abOAPm0.20±0.011a0.23±0.014a0.24±0.017a0.22士0.014aOAPl0.18士0.016ab0.20±0.034abc0.20±0.016be0.18±0.027beOMh0.14±0.019d0.14±0.024d0.17±0.015d0.】6士

33、0.015cdOMm0.19±0.018ah0.19±0.023be0.20士0.012be0.18士0.016beOM,.0.15±0.010cd0.18士().023c0.16士0.009d0.】6士0.020cdAPSh0.18士0.022ab0.20士0.016abc0.21士0.0151)0.18士0.026beAPSm0.19士0.019ab0.21士0.019ab0.21±0.019b0.20±0.020abAPSl0.17±0.019be0.18二0.017be0.18±0.013cd0.17±0.

34、013cd免疫对照Vaccinationcontrol0.13士0.020de0.14*0.012d0.16士0.013d0.】4±0.012d空口对照Blankcontrol0.H±0.013c0.14±0.021d0.】4士0.0J4d0.12±0.0)7e3.2中药成分复方及其组分药对新城疫苗免疫应答的影响血清抗体效价反映机体体液免疫状态.体液免疫是机体抗御感染的主要因素之.通过抗原-抗休结合反应而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多种作用。本试验结果表明.OAPh、（）APm在5个时间点、（）Mm和APSm在4个时间点、CAPl和APSh在3个时间点、

35、（）Mh和APSl在I个时间点的抗休效价均显著高于免疫对照组。表明OAIAPS和OM在合适的剂量均能刺激抗体产生,提高机体体液免疫水平.其中以OAPh、（）APm和AP%的作用较强。3.3中药成分复方及其组分药对免疫器官指数的影响一般认为.免疫器官指数降低为免疫抑制所致.而免疫器官指数增加则为免疫增强的表现M。本试验中（）APh、OAPm在各时间点的法氏囊指数、牌指数均显著高于免疫对照和空II对照m.（）APl在14,21和28日龄的法氏囊指数和各时间点的脾指数显著高于免疫对照组。除（）Mh在14和35日龄以及OAPl在35日龄的法氏囊指数高于免疫对照叩但差异不显著外.其余各药物组法氏囊指数均

36、显著高于免疫对照组。在脾指数方-面.（_）Mh在各时间点.OMl在14.28和35日龄.APSl在28和35日龄与免疫对照组无显著差异.其余各绢、各时间点均显著高于免疫对照叩。表明中药成分复方及其叩分药能增加免疫糖官质量.从而增强机休的免疫功能。3.4中药成分复方及其组分药增强免疫作用的量关系。在促进T淋巴细胞增殖方面,OAPh、OAPm在各时间点均显著高于免疫对照组，而OAPl在14日龄与免疫对照组无显著差异。（）M和APS的高、中剂量缉各时间点的A570值与免疫对照组相比较差异显著.而低剂量组在14日龄与免疫对照组无显著差异.这可能是因为剂最过小.不足以刺激机休产牛.致敏淋巳细胞所致，具体

37、原因还有待于进-步研究；在提高血清抗体效价方面,（）APh、（）APm在各个时间点均显著高于免疫对照组；OAPl在21,28和35日龄显著高于免疫对照组。在提高法氏囊指数方面.OAPh、OAPm各时间点的法氏囊指数显著高于免疫对照组;OAPl在14.21和28日龄显著高于免疫对照组.在35日龄与免疫对照组相比较差异不显著。Kong等皿在观察9种中药成分对新城疫|系疫苗免疫雏鸡血清中血凝抑制抗体水平影响的研究中.也得到了类似结果。3.5中药成分复方与其单味组分药增强免疫作用的比较在促进T淋巴细胞增殖方面,OAPh的板值显著商于C）Mh和APSh;在提高血清抗体效价方面-OAPh抗体效价显著高于O

38、Mh和APSh:在提商免疫器官指数方面.OAPh的法氏囊指数显著高于OM-OAP是由（_）M和APS组成的复方.其增强免疫作用优于单味组分药，表明两种组分药有协同作用。王德云等KN在研究当归多糖、黄此多糖、淫羊覆多糖、蜂胶黄酮等提高免疫调节作用时亦发现.中药成分幼万的免疫活性优于其单味叩分。综合以上结果可见（）AP能显著增强箱鸡对新参考文献IU沈留红邓崽丹,邓俊良等.“禽康散”对人T.感染NDV肉对红细胞免疫功能的影响J.扬州大学学报：农业与生命科学版.2013,34(2)：16-19.ShenLM,DengHI).DengJL,etal.I'hechangesofredbloodce

39、llimmunefunctionbycomplexChinesecrudedrug"Qinkan-gsan"onchickenartificiallychallengedbyNDV*J.JournalofYangzhouUniversity：AgriculturalandLifeScienceEdition，2013.34(2),1619.(inI'hinexe)2张宝康.王德云.孔祥峰.等.蜂胶黄酮增强免疫作用的研究口.扬州大学学报:农业与生命科学版.2006,27(3):20-22.ZhangBK.WangDY.KongXF.etal.Studiesonimmu

40、noen-IvincementofpropolisflavoneJJournalofYangzhouUniversity：AgriculturalandLifeScienceEdition.2006.27(3)：20-22.(inChinese)L3J韩庆功.崔艳红.赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用LJ1兽药与饲料添加剂,2006.11(2):19-22.IIanQG»CuiYfI.ZhaoYJ.Theapplicationofimmuneen-IvuicerinchickendiseaseprovejitionJ.VeterinaryPhamiaceulicitIs&

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