黄芪多糖佐剂对Ⅰ型鸭疫里氏杆菌灭活疫苗的作用研究.docx

1、黄茂多糖佐剂对I型鸭疫里氏杆灭活疫苗的作用研究金尔光，陈洁，钱运国，陈橙，曾新华，宫时玉，华娟（武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉430065）摘要：本研究以I型鸭疫里氏杆菌武汉分离株为菌种，经复苏、增菌、浓缩、灭活后与黄注多糖佐剂混合制成灭活疫苗。试验鸭在5日龄时按最佳免疫剂量（0.3mL/H）注射疫苗，免疫后第3、7、10、14、21天的攻毒保护率分别为100%、90%、100%、100%、90%,免疫后第3天即能用琼脂扩散法在血清中检测出I型鸭疫里氏杆菌特异性抗体，效价逐渐升高，至免疫后第10天达高峰（PV0.01）。试验结果表明，该灭活疫苗能有效预防鸭传染性浆膜炎。关键词：1型鸭疫里氏杆菌

2、；鸭传染性浆膜炎；黄芷多糖；灭活疫苗中图分类号：S862.4+3文献标识码：A黄芷多糖（astragaluspolysaccharideAPS）是中药黄茂中主要的天然活性成分，具有促进机体免疫功能、增加白细胞和淋巴细胞数量、提高淋巴细胞转化率和巨噬细胞活性、诱生干扰素等作用（Qiu等，2007）。本研究将APS作为免疫佐剂，与本地分离的I型鸭疫里氏杆菌（RiemerellaanatipestiferRA）混合制苗，并评价其保护效果,旨在提高传统灭活苗的免疫效果，有效地防控鸭传染性浆膜炎，也为新型免疫佐剂的研究提供依据。1材料与方法1菌种I型RA菌株分离自武汉郊区某肉鸭场，鉴定后冻干保存。1.2

3、 培养基胰酶大豆琼脂（trypticsoyagar,TSA）和胰酶大豆肉汤（trypticsoybroth,TSB）分别为Difco.Bact。产品，使用时加10%小牛血清。1.3佐剂原料黄度多糖提取物,纯度为75%。1.4 试验动物1日龄樱桃谷鸭，自由采食。1.5 疫苗制备1种子液制备I型RA菌株用TSA平板复苏后接种于TSB中，37笆摇振培养1824h,取培养液接种于TSA、血液琼脂平板进行纯度检查，合格后作为种子液.4°C保存，使用期不超过5d。1.5.2 菌液制备将种子液按培养液体积的5%接种到TSB中，37°C通气摇振培养24ho纯度检查合格后采用平板计数法进行细

4、菌计数，同时按菌液体积的0.4%加入甲醛溶液37°C灭活24h。灭收稿日2008-08-18作者简介：金尔光（1966），男，湖北人，本科.高级畜牧师，研究方向：动物生物技术及疾病防控技术。文章编号：1671-7236（2009）03-0151-02活后调整菌液浓度至1X10】°CFU/mL,接种于血液琼脂和TSA平板，5%CC）2、37°C培养48h,无菌生长者用于制备疫苗。1.5.3 APS佐剂制备及配苗将APS配制成所需浓度溶液，115°C灭菌15min后置4°C保存备用。将灭活菌液与佐剂按等体积混合，同时按总体积的0.01%加入硫柳汞，

5、制成棕色混悬液，即为鸭传染性浆膜炎APS灭活疫苗。1.5.4 疫苗的无菌及安全检查疫苗分别接种于TSA、TSB、血液琼脂及厌氧肉肝汤，37°C培养57d,观察有无细菌生长。30只5日龄健康未免疫樱桃谷鸭，随机分为3组，每组10只，分别于颈部皮下注射疫苗0.5、1.0、2.0mL/只，观察7d。1.6疫苗的免疫效果检验1攻毒菌量的测定I型RA强毒株经复苏、增菌后分别调整浓度至2X1O12X1O2X1O2X102X106及2X105CFU/mL；取70只15日龄健康未免疫鸭随机分为7组，每组10只，分别对应上述6个攻毒剂量和1个阴性对照组（生理盐水）进行攻毒，0.5mL/只，腿部肌肉注射

6、，观察7d,将导致全组试验鸭死亡的最小攻毒剂量定为攻毒剂量。1.6.2 最佳免疫剂量的筛选50只5日龄健康未免疫鸭，随机分为5组，每组10只，对应4个免疫剂量（0.2、0.3、0.5、1.0mL/只）和1个阴性对照组（生理盐水），颈部皮下注射。免疫后第15天按照1.6.1测定结果进行攻毒试验，攻毒后观察10do免疫接种及攻毒保护试验100只5日龄健康未免疫鸭，随机分为2大组即免疫组和阴性对照组，每组又分为5小组，每组10只，分别对应5个攻毒时间点：免疫后第3、7、10、14、21天。疫苗组按1.6. 2筛选的最佳免疫剂量注射疫苗，阴性对照组注射生理盐水，然后在相应的时间按照1.6.1测定结果进

7、行攻毒，腿部肌肉注射，观察7do免疫后血清抗体效价检测50只健康未免疫鸭5日龄注射疫苗，随机分为5组，每组10只，分别对应5个采样时间（免疫后第3、7、10、14、21天），全部在对应的时间颈静脉采血，采用琼脂扩散方法检测血清抗体效价，结果用log2表示，应用统计软件SPSS11.5进行分析。2结果1疫苗的无菌及安全检查制备的疫苗经实验室细菌学检查，无任何细菌生长；5日龄雏鸭颈部皮下接种O.5、lO、2.OmL疫苗，均未见异常反应。2.2攻毒菌量测定由表1可知，导致整组全部死亡的最小攻毒剂量为2X108CFU/mL、0.5mL/只，该剂量即为I型RA强毒的攻毒剂量。表1I型RA强毒攻毒剂测定结

8、果（n=10）组别攻毒菌液浓度（CFU/mL）注射剂量（mL）死亡鸭数（只）死亡率（%）12X1050.566022X1O60.588032X1O70.588042X1080.51010052X1090.51010062X10100.5101007生理盐水0.5002.3最佳免疫剂量筛选试验鸭按0.2、0.3、0.5、1.0mL/只剂量免疫后，攻毒保护率分别为80%、100%、100%、100%,阴性对照组无一存活，表明该疫苗的最佳免疫剂量为0.3mL/只，结果见表2。表2I型RA黄黄多糖灭活疫苗最佳免疫剂筛选结果蛆别注射剂量试验鸭数存活鸭数保护率（%）（mL/只）（只）（只）10.21088

9、020.3101010030.5101010041.01010100阴性对照组（生理盐水）0.510002.4 免疫接种及攻毒保护试验由表3可见，试验鸭接种1型RA黄芷多糖灭活疫苗后第3、7、10、14.21天的攻毒保护率分别为100%、90%、100%、100%、90%,平均保护率达96%。阴性对照组注射生理盐水后同样进行攻毒，第3、7、10、14天后攻毒死亡率为100%,第21天的死亡率为80%,余下的2只处杀后剖检，可见明显的纤维素性肝周炎和心包炎。表31型RA黄黄多精灭活疫苗接种后的攻毒保护试验结果免疫后天数（d）平均保护率（%）37101421疫苗组（存活鸭数/试验鸭数）10/109

10、/1010/1010/109/1096阴性对照组（存活鸭数/试验鸭数）0/100/100/100/102/1042.5 血清抗体水平检测免疫后第3天即能在试验鸭血清中测出I型RA的特异性抗体，随后抗体效价逐步升高，至免疫后第10天达到高峰（PV0.01）,结果见图1o图1I型RA中药多糖灭活疫苗接种后的攻毒保护试验结果（n=10）注：图中折线上字母不同者，表示差异极显著（PV0.01）。3讨论与小结黄芷是一种常用的补气中药，能调节机体免疫功能，APS是其中主要免疫活性成分，研究结果显示，APS与商品疫苗同时给鸡注射，可显著提高疫苗的保护作用（Qiu等,2007；Kong等，2004；李宏全等,

11、2005）；张华等（2005）还发现APS能迅速刺激试验兔的体液免疫和细胞免疫功能，并可较长时间维持较高水平。本研究将APS作为免疫佐剂进行配苗，成功研制出I型鸭疫里氏杆菌黄苗多糖灭活苗，最佳免疫注射剂量为0.3mL/只，5日龄雏鸭接种后第3、7、10、14、21天的攻毒保护率分别为100%、90%、100%、100%、90%,平均保护率高达96%,且安全性高，近7倍剂量免疫未见异常反应。该疫苗产生保护力较早，在免疫后第3天保护率即高达100%,血清抗体检测的结果却显示此时抗体效价相当低，这可能与免疫后时间间隔太短，以至试验动物体内未能产生足够的特异性抗体有关;APS是一种天然的免疫增强剂，能

12、在疫苗本身产生足够保护以前，提升整体的免疫水平，尤其是非特异性免疫水平，使机体不受强毒进攻的影响。该疫苗对细胞免疫的作用机理有待于进一步深入研究。本研究采用琼脂扩散方法检测试验鸭血清抗体水平，发现总体抗体水平不高（W1:8）,但攻毒保护试验结果显示平均保护率达96%,这可能与检测方貉源犬瘟热病毒的分离鉴定刘双翼，王进轶，王延涛，刘合义，侯喜林(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319)摘要：采集大庆某貉养殖场病貉的病料，处理后接种于非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离。对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定，并用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染细胞中的病毒核

13、酸。病料接种Vero细胞72h后产生明显的细胞病变(CPE)；病毒分离株可以被犬瘟热病毒阳性血清中和中和效价为1:25；分离株对氯仿、乙隧敏感,对酸和热抵抗力弱，可以凝集鸡红细胞，其凝集作用可被犬瘟热病毒阳性血清所抑制；RT-PCR检测病毒细胞培养液，扩增出的片段长287bp,与预期设计的长度相同，经测序发现与MS01株的同源性为99%。结果表明，分离的病毒株为犬瘟热病毒.命名为CDVDQ株。关键词：貉3犬瘟热病毒3分离；鉴定中图分类号:S858.92文献标识码：B犬瘟热(caninedistemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(caninedistempervirus,CD

14、V)引起的感染多种动物的一种急性、高度接触收稿日期：2008-09-08作者简介：刘双翼(1983-).男,内蒙古人，硕士生，研究方向：分子病毒学。通信作者：侯喜林.男.教授.硕士研究生导师。Emaihxlyhouyahoo,Tel或其他某些原因有关，需要进一步研究证实。参考文献1张华.薛家宾，黄克和，等.不同佐剂对兔出血症灭活冻干疫苗免疫效果的影响J.中国兽医学报.2005,25(3)：138140.2李宏全.段县平，马海丽，等.黄芷多糖对鸡新城疫和传染性腔上囊病疫苗免疫力的影响口.中国兽医科技,2001,31(9)：1214.3贺奋义.鸡减蛋综合征油乳剂灭活苗的

15、研制口.中国畜牧曾医，文章编号：1671-7236(2009)04-0153-04性传染病。已有的研究结果表明，犬瘟热病毒可感染犬科的其它动物(如狐、狼)及鼬科、浣熊科、猫科(如狮、虎、豹)等。Mee等(1998)还从患PAGRTS疾病的病人组织中检测出CDV核酸。近年来试验结果表明，CDV可感染人宫颈癌细胞系，因此人亦有可能感染(Laffler等，1997),故对该病毒进行研究具有潜在的公共卫生意义。2006年2007年在黑龙江省大庆地区的貉群AYXXAYAYAYAYAAAAYAYAAY»<><AYAYA2005,32(6)：4547.4 KongX,HuYRui

16、Retal.EffectsofChineseherbalmedicinalingredientsonperipherallymphocyteproliferationandserumantibodytiteraftervaccinationinchicken.InternationalImmunop-harmacology,2004,4(7)：975982.5 QiuYHuYL,CuiBAetal.ImmunopotentiatingeffectsoffourChineseherbalpolysaccharidesadministeredatvaccinationinchickens.Poul

17、tryScience,200786(12)：25302535.StudyontheEffectofAstragalusPolysaccharideAdjuvanttoInactivatedVaccineofRiemerellaAnatipestiferSerotypeIJINEr-guang,CHENJie,QIANYun-guo.CHENCheng,ZENGXin-hua,GONGShi-yu,HUAJuan(WuhanInstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,Wuhan430065.China)Abstract：Aninactivatedastraga

18、luspolysaccharide(APS)adjuvantvaccinewasdevelopedwithRiemerellaanatipestifer(RA)serotype1isolatedfromWuhaninthisresearch.Duckswereinoculatedwithoptimaldosage(0.3mL/duck)attheageof5-day.Theprotectionrateswere100%,90%,100%,100%and90%onthe3rd,7th,10th,14thand21stdayaftervaccination,respectively.Immunodiffusionassayshowedth