非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用

1、    非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用            作者：时间：2007-11-22 14:50:00                           

2、             作者：赵学铭，刘易欣，倪春生，赵秀兰，孙 涛，古强，孙保存 【关键词】  ,间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养,    摘要  目的  研究与恶性黑色素瘤细胞进行非接触式共培养的间充质干细胞表型变化，从而明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。        方法  利用Transwell进行非

3、接触式共培养，分析间充质干细胞形态变化，利用免疫组织化学与免疫荧光检测其因子和CD34表达。        结果  间充质干细胞在非接触式共培养体系中可以被恶性黑色素瘤细胞诱导为多角形或短梭形，同时因子和CD34表达上调。        结论  初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的间充质干细胞中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。      

4、;  关键词  间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养               Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system              Abstract  Objective  To

5、 study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.        Methods  Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determinat

6、ion of the expression of  factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.        Results  MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show factors and CD34 was upregulation

7、 of MSC.         Conclusion  The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculture system may used in cell interaction research in vit

8、ro.        Key words  mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture               间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力，又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分

9、化的潜能1,2。它有着广泛的来源，包括骨髓、骨骼肌、软骨、骨、肌腱等，故在干细胞研究领域中具有突出的优势及非常重要的理论研究意义和临床应用价值。        笔者希望通过进行MSC细胞和恶性黑色素瘤细胞的非接触式共培养，观察不同培养条件下的MSC形态，检测多种指标免疫组织化学染色结果、分析差异，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的MSC中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。        1  材

10、料与方法        2  实验结果        实验中单独培养对照组可见有大量紧密贴壁生长的细胞，贴壁细胞形态主要表现为梭形细胞，胞核呈卵圆形，细胞形态较一致，为成纤维细胞样形态，呈较典型的MSC形态。非接触式共培养组部分MSC细胞光镜下为成纤维细胞样形态；部分细胞为多角形或短梭形，边界清晰，大小较均匀，胞核圆形或椭圆形，位于细胞中央，见图1和图2。        

11、60;     非接触式共培养体系中B16细胞对MSC细胞的诱导分化作用实验中，经对比观察单独培养对照组（表1）与非接触式共培养组（表2）中96孔MSC细胞IHC和免疫荧光结果，呈现单独培养对照组CD34阴性（阳性率4.8%），因子阴性（阳性率5.5%）；呈现非接触式共培养实验组CD34阳性（阳性率50.9%），因子阳性（阳性率42.2%），见图36。并应用SPSS统计软件进行2检验分析共培养组与对照组在CD34和因子这2个指标间平均阳性细胞数的差别（表3），结果表明实验组与对照组在CD34和因子这2个指标上差异有非常显著性（P<0.01）。

12、60;       表1  单独培养对照组MSC细胞两种检测指标  略     表2  非接触式共培养组MSC细胞两种检测指标  略    表3  共培养组与对照组MSC细胞两种检测指标表达差异略        图1  图6  略        3  讨论   

13、;     本实验中培养的间充质干细胞紧密贴壁生长，形态较均一，其形态特征基本上为梭形的成纤维细胞状，符合骨髓间充质干细胞形态3。细胞CD34及因子阴性，排除了造血细胞和内皮细胞的可能性4,5。综合分析上述结果证明本次实验中对照组培养的细胞符合小鼠骨髓间充质干细胞的特点，是未产生分化小鼠骨髓来源间充质干细胞。        血管内皮是指血管内壁覆盖的一层上皮细胞，具有许多重要标志，主要包括：因子关联抗原（von willebrand factor，vWF），可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要

14、用相应的抗体。vWF具有很高的特异性，通常认为它是反映内皮细胞的最好指标6，如人的vWF抗体对牛的内皮细胞没有交叉反应。        本次实验中非接触式共培养组中MSC细胞光镜下    部分细胞为多角形或短梭形；IHC和免疫荧光结果呈现CD34阳性，因子阳性，并且通过统计分析得到共培养组与对照组在CD34和因子2个指标上差异均有非常显著性（P<0.01）。以上结果初步证实与B16非接触式共培养的MSC部分细胞发生向内皮细胞方向分化。     

15、60;  此次实验采用了非接触式共培养7，此种培养体系排除了以往接触式共培养的细胞混杂不利于后期观察和区分结果的弊端，细胞分类明确，变化一目了然。而且当培养体系中细胞间相互作用需要通过建立细胞间紧密连接和（或）需要采用旁分泌的作用方式时，则不会引起靶细胞变化。根据非接触式共培养体系的特点，可以进一步推测B16细胞是否通过向共同培养体系中分泌较高含量的某种或某些细胞因子对MSC产生作用，导致MSC的分化。        综上所述，本研究通过体外进行的非接触式共培养实验，初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的MSC中部分细胞

16、表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞间相互作用及作用方式的研究。虽然，本研究还无法说明B16诱导MSC分化的具体方式以及确切机制，但是笔者认识了MSC在血管形成中的作用，以及非接触式共培养体系在研究细胞间相互作用及作用方式的重要作用。        参考文献        1 Minguell JJ, Erices A, Conget P.Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med，2001，226（6）:507-520.

17、60;       2  Friedenstein AJ, Gorskaja JF,Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradicated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol，1976，4（5）:267-274.        3  Guo ZK,Yang JQ, Liu XD, et al.Biological properties of mesenchy

18、mal stem cells derived from bone marrow.Chin Med J，2001，114（6）:950-953.        4  Huss R, Lange C, Weissinger EM,et al.Evidence of peripheral bloodderived,plasticadherent CD 34 （-/low）hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cells，2000，18（1）:252-260.