鸡传染性支气管炎诊断技术和疫苗研究进展.docx

1、鸡传染性支气管炎诊断技术和疫苗研究进展宋远鸿'，毛响德2(1.山东省苍山县畜牧局，山东苍山277700；2,北京康牧兽医药械中心)中国图书分类号:S858.31文献标识码:A文章编号：1006799X(2011)01003404鸡传染性支气管炎(AvianInfectiousbronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(A.vianInfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道疾病,主要以张口呼吸、咳嗽、气管罗音、腺胃肿大、出血、“花斑肾”为主要特征。自1931年Schalk等首次报道了经典的呼吸型禽传染性支气管炎(IB)并确定为病

2、毒性疾病以来，已有肠型、腺胃型、肾型等多种病型相继报道。该病可感染所有日龄的鸡，已发展成为影响养禽业发展的重要疾病之一，因此对该病的研究具有非常重要的意义。1IBV的检测方法IBV新的血清型不断增加和变异株的不断出现，给IB的诊断和防制带来了很大的困难。如何进行快速、准确的诊断IB以及调整免疫程序是非常关键的。由于IB症状不典型，易与多种疾病混淆，IB的确诊只能靠实验室诊断,包括病毒的分离鉴定、血清学诊断方法等,也有些新兴的分子生物学方法。1.1病原学诊断一般可根据病史从感染鸡的气管、肺脏、肾脏、扁桃体、泄殖脱等组织采样，接种鸡胚或气管环进行病毒分离。一般认为气管是早期分离IBV的首选部位，但

3、感染后1014d就不易分离到。同时在消化系统，特别是盲肠、扁桃体组织或粪便中分离到病毒的成功率也是较高的。李康然等建议按如下程序分离IBV病毒效果较好:采集病料一过滤双抗于4T46h后接种9-100龄鸡胚48h后鸡胚盲传35代，HA检查阴性,NDV干扰试验阳性，侏儒胚阳性等进一步做IBV鉴定。然后还要根据理化特性、核酸型鉴定、生物学特性、血清学鉴定等进一步鉴定。1.2血清学诊断1.2.1琼脂扩散实验(AGP)：Roussan31证实以感染IBV的鸡胚绒毛尿囊膜制备AGP抗原用以检测IBV的抗体是可行的,且以感染1620h的材料制备抗原最佳。AGP具有足够的灵敏性和特异性。AGP抗体阳性率与病毒

4、的致病性、病毒的感染剂量、鸡的日龄及感染时抗体的存在状态有关。1.2.2中和试验(VN)：VN实验是鉴定IBV的经典方法，鉴定结果有很强的实际意义。中和试验可在鸡胚、鸡胚肾细胞(CEKC)或气管环培养物上进行，广泛用于IB野毒株的分离和鉴定及血清分型。通过对IBV在CEKC和气管环组织培养物上的适应性的比较,认为比CEKC更适用。但其也有操作复杂、费时、费力、价格昂贵、结果判断具有主观性等缺点。1.2.3酶联免疫吸附试验(EIJSA)：自1981年Junquardt首次成功应用ELISA以来，ELISA广泛应用于IBV抗体的检测。它比其他方法要灵敏,有研究证实它是VN实验的23倍、AGP实验的

5、188倍。江经纬以致病性较强的传染性支气管炎毒株IBVM41株为研究对象，通过免疫保护试验，抗体检测试验说明IBV人工发病模型可用于评价IB毒株的致病性和评价弱毒疫苗的保护效力，该ELISA方法可以用作检测IB疫苗抗体水平。1.2.4免疫荧光法（IFA）：该法可用于抗原检测及抗原组织定位的研究。检测抗原的步骤:将病料滴在载玻片上，固定后，滴加IBV抗体,37P下在湿盒内作用1h,冲洗20min,加入荧光素标记的二抗，室温下作用lh,冲洗如上，镜检。免疫荧光抗体法在检测鸡传染性支气管炎中具有快速、便捷的特点，尤其在IBV的抗原定位中应用更为广泛，而且结果的判定具有直观性。朱建国等选用了一株反应谱

6、广的单抗作一抗，建立了单抗介导的间接荧光抗体法，用于检测鸡胚尿囊细胞中的IBV,其具有很高的特异性，能够迅速做出定性检测，应用IFA鉴定IBV型特异性和群特异性抗原，准确率达70%o2分子生物学诊断技术2.1RT-PCRRT-PCR技术是一种选择性体外扩增DNA或DNA片段的方法，具有特异、快速、灵敏、简便等优点，目前该方法在NDV检测和诊断中的应用也很广泛。将从商品肉鸡场采取的IBV样品，反转录成DNA后，用PCR扩增,然后用荧光定量PCR+HRM系统，检测IBV3PTR从而得到了230435bp的目的产物。而对华东地区鸡传染性支气管炎病毒M、N基因用RT-PCR检测方法证明RT-PCR技术

7、具有敏感、特异、快速等特点，适用于不同来源及不同血清型IBV的检测。2.2核酸探针该技术具有很高的敏感性。原理是利用合成的特异核酸探针与PCR扩增的待检IBV基因片段杂交，如果IBV基因片段与已知核昔酸并标记同位素的探针互补，则两者结合,X底片就会显影；反之则不显影，具有很高的敏感性。Kwon应用PCR和生物素标记的DNA探针检测了接种IBV的SPF鸡气管中的IBV基因组，证实此法比电镜（EM）观察病毒法要灵敏。以地高辛（DIG）标记鸡传染性支气管炎病毒（IBV）pol基因的保守片段制成'核酸探针，结果表明，利用DIG探针检测IBV的RT-PCR产物，特异性和敏感性强，可重复，能克服R

8、T-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性。利用核酸探针的群特异性，根据传支病毒基因组中相对最为保守的N基因设计引物，检测结果稳定，重复性好，且在检测时，不需要特殊的仪器设备。因此，特别适宜于基层对IBV的诊断和流行病学调查。3IBV的疫苗研究进展3.1IB弱毒疫苗弱毒疫苗是由抗原性很好的毒株通过鸡胚连续25代以上传代获得的。一般以Mas-sachusetteIBV是世界范围内分布最广泛的血清型，并且该型能对异型毒株也产生较好的免疫力，该血清型的H52、H120应用最为广泛,其次为Conn疫苗株。活疫苗的优点是能有效刺激机体的体液与细胞免疫，方便生产且成本低。缺点是其致弱程度难

9、以掌握，疫苗的运输、贮藏和使用等条件的要求高，但最主要的是疫苗株有一定的致病力和传播能力,接种疫苗后引起轻度的呼吸道反应，并且当鸡群中存在致病性支原体时，会成为慢性呼吸道病暴发激发因素。3.2IB核酸疫苗弱毒疫苗常常能有效地刺激机体的免疫系统，激发体液免疫和细胞免疫两种免疫力，且局部免疫后能引起较高的局部抗体（IgA）应答。因此，在保护商品化产蛋鸡方面具有良好的应用价值。步志高等以克隆的国内类M41地方流行株IBV纤突糖蛋白S1基因为免疫原基因，构建了DNA免疫表达质粒，并对其免疫原性进行了初步分析，结果表明，该表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应。白天、王红宁等通过对

10、传染性支气管DNA疫苗在鸡体内的分布与安全性检测证实DNA疫苗的安全性好。唐梦君等将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中，构建IBVM和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。结果表明，禽源IL-18基因与IBVM基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答，提高对IBV强毒的抵抗力。3.3活病毒载体疫苗活病毒载体疫苗是用基因工程方法将一种病原免疫相关基因整合进另一种载体基因组DNA的复制非必须片段中构成的重组活载体疫苗。常作为活载体疫苗的有禽痘病毒、疱疹病毒、反转

11、录病毒、转基因植物等。如Zhou等用脓杆菌系统构建含有IBVS1基因的载体转化马铃薯，在马铃薯中表达了IBVS1糖蛋白并免疫鼠和鸡，通过3次免疫后,免疫鸡受到部分保护，此结果表明，转基因马铃薯表达的IBVS1糖蛋白也可作为防治IBV的疫苗。WangX等用重组鸡痘病毒表达了M41株的S1基因，免疫鸡受到部分保护。实验结果表明，翅下免疫接种效果更好，另一方面，鸡患急性传染性支气管炎时，诱导产生旺盛的细胞毒细胞活性，这种细胞反应与感染疾病的最初下降有关。将共表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)Sl基因和鸡干扰素)基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFN)S1)接种4周龄SPF鸡，免疫3周后用同源(LX4株

12、)及异源强毒株(LTJ951)攻毒，评价重组疫苗对异源病毒的保护作用。结果可以说明，重组疫苗能对同源强毒株产生较好的免疫保护，但不能对遗传关系较远的强毒株产生有效的免疫应答。4小结目前1BV的诊断方法有很多，其中RT-PCR技术是用于实验室诊断最常用的方法之一,但是每一种方法均有其优点和缺点，我们应该根据实际需要，结合实际条件和操作经验，选择适宜的检测方法或将几种方法结合，做出最终的判断。IBV疫苗中的弱毒苗和灭活苗依然存在,像容易散毒,引发不同毒株间重组现象的发生，免疫持续时间短以及免疫效果差等不足。新兴基因工程苗较传统疫苗具有安全、省时、省力、能够克服某些病原不能用传统方法研制疫苗的弱点，

13、并具有诱人的研究价值和广阔的应用前景，但也仍存在免疫保护效果不佳、临床效果不明等缺点。所以当前生产上仍然采用减毒活苗和灭活苗为主相结合的方法去预防和控制该病。主要参考文献1BoursnellME,BrownTD,FouldsIJ,etaLCompletionofthesequenceofthegenomeofthecoronavimsavianinfectiousbronchitisvinisfJ.JGeneVirol,1987,68：57-77.2 ZarirahMZulperi,AROmar,SSArshad.SequenceandphylogeneticanalysisofSI,S2,M

14、,andNgenesofinfectiousbronchitisvimsisolatesfromMalaysiaJ.VirusCenesetaL2009,38(3):383-391.3 RoussanDerghamA,Khawaldeh,aal.InfectiousbronchitisvirusinJordanianchickens：Seroprevalenceanddc-tectionJ.CanadianVeterinaryJournal,2009,50(1)：77-80.4 江经纬，谭碧珊，解明.克隆和表达传染性支气管炎S蛋白复合抗原表位作为的备单克隆抗体的免疫原J.广东畜牧兽医科技,20

15、07,32(1):38-39.5朱建国.用单克隆抗体介序的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气骨炎病毒的研究J.中国预防兽医学报,1996,1(1):6-8.6时莉，肖朝廷，宋空远，等.我国部分地区1996-2008年传染性支气管炎病毒分离株膜蛋白基因的遗传变异与系统进化分析口.中国动物传染病学报,2009,17(2)：31-37.植酸酶在生长猪饲料中的应用研究付惠玲（平罗县畜牧技术推广中心，宁夏平罗753400）>中国图书分类号:Q556文献标识码:A文章编号:1006799X（2011）01-0037-05磷是生命体的重要组成部分，现代动物生产条件下，磷已成为配合饲料必须考虑的、添

16、加量较大的重要营养素。常规植物饲料原料中含磷十分丰富，但其中约2/3的磷是以植酸璘的形式存在的。猪、禽等单胃动物体内缺少内源植酸酶或植酸酶的活性极低，不能充分水解植酸磷。不能被单胃动物利用的植酸磷排泄出来后被环境中的微生物降解为无机磷，其中一部分通过地表径流和渗透进入江河湖泊,造成水体的富营养化，导致藻类和其他浮游微生物大量生长繁殖，水体的溶氧量降低，水质恶化，从而引起鱼类和其它水生动物大量死亡，因此大量排放到环境中的磷会对生态平衡带来很大的影响O植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷,将植酸（盐）降

17、解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。本文将从植酸酶的研究情况，对猪生长发育及其生理指标的影响、影响植酸酶活性的因素等方面立体地对植酸酶做介绍。I植酸酶的研究历史与现状植酸酶（phytase）是一种专一性水解植酸成为肌醇与无机磷酸的单脂水解酶，主要存在于植物籽实中，最早由Suzuki于1907年在米糠中发现。1968年，植酸酶首次作为添加剂被应用于饲料中，在促进动物生长、提高机体对植酸磷的利用效率等方面都表现出良好效果，因而受到人们的普遍关注（Nelson,1968）o此后,研究者对植酸酶在改善饲料转化效率、降低粪磷排泄和促进机体对日粮养分如蛋白质的吸收利用，促进动物生长等方面进行了研究,均取得良好效果。近年来，通过基因工程的方法获得耐酸、耐热的植酸酶工程菌是目前植酸酶的研究热点。具体方法包括植酸酶新基因的克隆，植酸酶的分子改造，晶体分析和植酸酶的转基因研究等。2