鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展.docx

1、南方农业学报JOURNALOFSOUTHERNAGRICULTURE2012,43(6):869-872ISSN2095-1191;CODENNNXAABDOI：10.3969/j：issn.2095-l191.2012.06.869鱼用口服疫苗免疫佐剂研究进展黄钧】,施金谷巳陈明2,黄艳华I,温华成：彭民毅)王瑞2,梁万文2(】广西大学动物科学技术学院/广西水生动物疾病诊断实脸室，南宁530005；2广西水产研究所/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁530021)摘要:免疫佐剂是一种先于或与抗原同时使用，能够增强机体的非特异性免疫能力及相应抗原的免疫原性，但其本身不具备抗原特性的物质

2、。文章对鱼用口服疫苗免疫佐剂的作用机理以及霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、细胞因子等儿种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂的应用情况进行综述，发现鱼用口服疫苗免疫佐剂的研究应用过程中仍存在作用机理研究相对滞后、忽略肠道黏膜免疫机理特殊性、使用成本过高、安全性等问题,建议今后加强对鱼类肠道黏膜免疫机理以及口服疫苗免疫佐剂作用机理的研究,优化曰服疫苗免疫佐剂的免疫剂星和程序，降低生产成本,研发出更为广泛、廉价的口服疫苗免疫佐剂,提高其安全性等,以促进水产养殖业的健康发展。关键词：鱼用口服疫苗；免疫佐剂；霍乱毒素；大肠杆菌不耐热肠毒素；细胞因子；应用现状中图分类号：S948文献标志码:A文章编

3、号:2095-1191(2012)06-0869-04AdvanceinoralvaccineimmuneadjuvantforfishHUANGJunSHIJin-gufCHENMing2,HUANGYan-hua',WENHua-cheng1,PENGMin-yi1,WANGRui2,LIANGWan-wen2CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity/GuangxiAquaticAnimalDiseaseDiagnoseIxib,Nanning530005,China;2GuangxiResearchInstitut

4、eofFisheries/GuangxiKeyLaboratoryofAquaticGeneticBreedingandHealthyAquaculture,Nanning530021,China)Abstract:Thoughadjuvantitselfdoesnotpossessantigencharacteristics,whenitisusedbeforeortogetherwithantigen,itcanfortifynon-specificimmunityabilityandimmunogenicitytotheantigen.Mechanismoforalvaccineimmu

5、neadjuvantforfishesandthecurrentapplicationstatusofmajoradjuvantsincludingcholeratoxin(CT),heat-labileenterotoxin(LT)andcytokinewerereviewedinthepaper.Severalproblemswerefoundsuchaslaggedmechanismresearch,ignorancetoparticularityofintestinalmucosalimmunity,highcost,andsafely,etc.Tostimulatesounddeve

6、lopmentofaquacultureindustry,aslewofmeasuresshouldbeadoptedincludingsustainingresearchesonmechanismofintestinalmucosalimmunityandoralvaccineimmuneadjuvant,optimizationofimmunizingdoseandprocedureoforalvaccineimmuneadjuvant,decreasingdevelopmentandresearchcost,developingcheaperandsaferoralvaccineimmu

7、neadjuvant,soenhancingitssafetytopromotehealthdevelopmentofaquacultureindustry.Keywords：oralvaccineforfish；adjuvant;choleratoxin(CT)；heat-labileenterotoxin(LT)；cytokine；applicationstatus收稿日期：2012-03-21基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻1123006-4)作者简介:黄钧(1957-)，副教授,主要从事水产动物健康养殖及病害防控技术的教学与研究工作,E-mail：hi135l0引言近几

8、十年来,随着国内外学者对鱼类肠道免疫机理的研究不断深入,鱼用口服疫苗的研制取得长足发展,与之密切相关的鱼用口服疫苗免疫佐剂也越来越受到重视。免疫佐剂是一种先于或与抗原同时使用,能够增强机体的非特异性免疫能力及相应抗原的免疫原性，但其本身不具备抗原特性的物质。常见的免疫佐剂有铝盐佐剂、弗氏佐剂等，这些佐剂通常是作为注射型免疫佐剂，既能保护抗原，又能够增强机体对抗原的吸收，增强免疫效果(Dotsikaetal.,1997；陈明等,2010)o目前，人们已研制出多种口服疫苗免疫佐剂。Merino-Contreras等(2001)以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(CTB)作为佐剂对斑带副鲂进行口服免疫，

9、结果发现以CTB作为佐剂组的抗体效价水平最高,其免疫保护率高达70%,并能防止由维氏气单胞菌所引起的组织损伤。常青等(2006)通过在饲料中添加壳聚糖投喂花鲂30d,其机体的补体活性、溶菌酶活性及吞噬活性显著增强。此外,脂质体、海藻酸钠、霍乱毒素(CT)、细胞因子等均被动物试验证明其能够有效地引起免疫反应。1鱼类口服疫苗免疫佐剂作用机理免疫佐剂不仅可以改变免疫球蛋白的种类，还可以改变免疫反应强度、增强免疫应答、诱导机体产生特异性免疫、消除机体产生的免疫耐受、减少机体免疫副反应等(Anderson,1992)。目前，关于鱼类口服疫苗免疫佐剂的研究主要集中在是否具备佐剂效应,而其机理研究尚处于推测

10、阶段，有关免疫佐剂在机体内与免疫细胞、免疫分子间相互作用以及对于信号通路等均有待进一步探索。现有的免疫佐剂作用机理研究主要集中在人类和小鼠,这些研究成果对鱼类口服疫苗免疫佐剂研究具有重要的指导意义。一般来说，佐剂免疫机理包括4个方面:(1)起免疫调节作用，主要是对体内细胞因子进行反馈调节，通过细胞因子的升高或降低来介导免疫反应(O*Haganetal.,2001),表现为由辅助性T细胞(Th)中Th1细胞介导的细胞免疫、Th2细胞介导的体液免疫。(2)起抗原呈递作用，口服疫苗免疫佐剂能够保持抗原构象的完整性，并增强抗原的呈递作用,使抗体能够更好识别抗原而产生免疫反应。如左旋咪哇能够抑制可溶性免

11、疫抑制因子，降低其氧化率，从而增强抗原的呈递作用(Allison,1998)0(3)起靶向性作用，如脂质体等经H服后,能释放抗原或被抗原呈递细胞(APC)吞噬后释放其包裹的抗原;海藻酸钠微囊等微球佐剂则能通过APCs靶向巨噬细胞，促进抗原加工(Langeretal.,1997)。(4)诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,而具有储存功能(孙红祥和潘杭君,2005)。2几种主要鱼用口服疫苗免疫佐剂2.1霍乱毒素(CT)CT是由霍乱弧菌产生的一种肠毒素，由一个A亚单位和5个B亚单位连接形成的AB5结构。CTA是一个毒性亚单位，除了具有与CTB连接的功能外，还具有ADP核糖基转移酮活性，能够

12、通过活化G蛋白引起细胞内环磷酸腺苜(cAMP)浓度升高，从而导致腹泻。CTB是无毒的受体结合亚单位，能够与细胞膜上的神经节昔脂受体结合，诱导细胞构型改变，将CTA转移到细胞膜或胞浆内。CT和CTB都是一种较强的免疫佐剂,但由于CT具有肠毒性，限制了其作为佐剂的可能性。CTB与抗原同时免疫动物时,能够极大增强免疫动物对抗原的特异性免疫应答。同时,CTB还是一种良好的弱免疫原和蛋白半抗原的载体,能够增加弱免疫原的免疫原性，使蛋白半抗原获得免疫原性。目前，关于CTB的研究主要集中在小鼠。Derzbaugh等(1990)经口服途径给小鼠免疫300-600昭CTB和链球菌糖基化转移酶的融合蛋白后，检测其

13、血清抗体水平,结果显示，该融合蛋白可诱导产生的抗体水平达200400倍。Merino-Contreras等(2001)提取维氏气单胞菌的胞外凝集素(MCBP)后，以CTB作为佐剂对斑带副鲂进行口服免疫，同时设计MCBP组和MCBP微囊组，结果表明，以CTB作为佐剂组的抗体效价水平最高，其免疫保护率高达70%,且能防止由维氏气单胞菌所引起的组织损伤。Isaka等(2004)研究发现,将重组rCTB和牛血清蛋白(BSA)混合后经口服途径免疫小鼠,能够在小鼠肠道产生中度水平的BSA特异性IgA应答，且能引起高水平的血清IgG应答;单纯服用BSA组则无特异性免疫产生。2.2大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)

14、LT是由大肠杆菌毒性株产生的一种肠毒素,与CT相似，也是由一个毒性A亚单位和非毒性五聚体B亚单位以非共价键连接而成的AB晶构。LTA具有ADP核糖基化活性，能够使肠道上皮细胞合成cAMP并分泌大量的肠液和电解质，引起腹泻。由于LTA具有毒性，因而限制了LTA作为免疫佐剂的应用前景。LTB能够识别细胞表面的单唾液酸四己糖(GM1)神经节甘脂以及其他受体,而常被作为抗原载体，与抗原联合使用，加强机体对抗原的摄取，增加其免疫应答能力(陈明等,2010)o同时,B亚单位与GM1结合是LT发挥免疫原性的基础。LT及LTB在动物中的研究应用较常见。张茂林等(2004)将狂犬病毒减毒疫苗与LT混合后，分别通

15、过灌胃、灌肠、口腔滴入的免疫途径对小鼠进行免疫,经检测免疫小鼠的IgGJgA及免疫保护率等指标，发现肠道免疫组的免疫应答水平明显高于口腔滴入和灌胃接种的免疫水平。Companjen等(2006)研制出成日和一种病毒肽融合蛋白转基因土豆,经肛门免疫途径免疫鲤鱼,结果发现,与对照组相比,试验组的血清效价显著提高，但由于试验动物过少,LTB作为水产口服疫苗免疫佐剂仍有待进一步研究探讨。Wang等(2012)将狂犬病毒糖蛋白(RV-G)基因片段和LTB基因片段融合后插入pVAXl真核质粒，并将该重组真核表达质粒转染到减毒沙门氏菌中形成pVAXl-G-LTB重组株,用该重组株口服途径免疫小鼠，狂犬病毒I

16、gG抗体检测结果显示，重组株诱导产生的IgG抗体水平明显高于对照组;而动物保护性试验结果表明，重组株的保护率达50%。可见，LTB能有效诱导机体激发细胞免疫和体液免疫。2.3细胞因子细胞因子是一类可溶性的小分子蛋白质或多肽,能够作用于细胞膜表面受体，促使免疫细胞增殖分化,从而加强免疫细胞活性或深入影响细胞内生物活性物质的表达和分泌。近年来，随着细胞因子深入研究，已发现多种细胞因子具有免疫佐剂效应，如包细胞介素(1L)、肿瘤坏死因子(INF)、淋巴因子(1L-2)、细胞干扰素(a罚干扰素)等oJimenez等(2006)将虹含尊病毒性出血败血症病毒G蛋白DNA疫苗与1L-8共同免疫虹刍尊，发现其

17、能够促进机体免疫细胞分泌细胞因子,增强机体免疫力。Diaz-Rosales(2009)对IL-2进行克隆表达及生物活性分析，发现大肠杆菌重组儿-2能够刺激转录因子STAT5和Blimp-1分泌，由于STAT5和Blimp-1是一类能够诱导成熟B淋巴细胞发育为浆细胞的蛋白，因而推测IL-2可作为一种免疫辅助手段来增强机体免疫反应。虽然目前细胞因子在水产上的研究应用相对较少，但其作为口服疫苗佐剂特别是DNA口服疫苗免疫佐剂将成为一个新的研究热点。2.4其他口服疫苗免疫佐剂除了CT、LT和细胞因子3种免疫佐剂外，还包括有化学药物、海藻酸钠、壳聚糖、脂多糖等。Lavelle和Harris(1997)将

18、甲氤米肌、碳酸氧钠和疫苗同时拌入饲料后投喂虹统，1h后检测发现其胃肠道pH升至7.24；取不同时间的肠道粘液和血液进行丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),发现抗原的完整性和大分子片段与对照组相比均有明显提高。McLean等(1999)在鱼的腺激素(HGG)中添加氢氧化铝或CTB,发现其不仅能增加机体对HGG的吸收，还能增强抗原抗体间的相互作用。Vervarckea等(2004)研究发现,在海藻酸钠微囊中加入维生素E、水杨酸钠、水溶性维生素E(TPGS)等，均能提高肠道及血液对抗原的吸收量，同时检测到皮肤粘液中的抗体水平高于空白对照组。常青等(2006)通过在饲料中添加壳聚糖投喂花鲂30d,发

19、现机体的补体活性、溶菌酶活性和吞噬活性显著增强。郑克孝等(2008)将海藻酸钠制成球形凝胶颗粒，通过细胞培养试验，发现海藻酸钠对刺激树突状细胞的成熟具有与肿瘤坏死因子细菌脂多糖相当的作用。3展望目前,有关口服疫苗免疫佐剂的研究主要集中在兽用，鱼用口服疫苗免疫佐剂的研究资料却很少。Jimenez等(2006)和常青等(2006)的研究结果为鱼用口服疫苗免疫佐剂领域的研究提供了有益的参考。鱼用口服疫苗免疫佐剂研究应用遇到的障碍:首先是其作用机理研究相对滞后,虽然兽用疫苗免疫佐剂能够给予一定的方向性指导，但鱼类的免疫系统相对低级,且有其自身的特殊性，如极具发展前途的胞壁酰二肽(Muramyldipe

20、ptide,MDP)在鱼类免疫过程中却未表现出明显的佐剂效应;其次，当前对口服疫苗免疫佐剂的研发一般是以鱼类注射免疫剂量和免疫程序作为参照，忽略了肠道黏膜免疫机理的特殊性，从而影响了口服免疫效果;再次,价格也是影响口服疫苗免疫佐剂推广应用发展的重要因素,如生产材料昂贵、制作繁琐、使用剂量大、多次免疫均可导致免疫佐剂使用成本过高；此外，口服疫苗免疫佐剂本身的安全性及使用剂量也是制约其发展的关键因素。上述问题均是限制鱼用口服疫苗免疫佐剂研发及其在鱼病防治上大规模使用的重要因素。因此，加强对鱼类肠道黏膜免疫机理以及口服疫苗免疫佐剂作用机理的研究,优化口服疫苗免疫佐剂的免疫剂量和程序，降低生产成本，研

21、发出更为广泛、廉价的口服疫苗免疫佐剂，提高其安全性等将是今后鱼用口服疫苗免疫佐剂的研究重点。随着鱼用口服疫苗免疫佐剂的进一步研究利用,尤其是对其作用机理、免疫程序、免疫剂量等方面的深入研究,鱼用口服疫苗免疫佐剂将成为增强鱼类免疫水平、防治鱼病的有效途径，同时对保护水产养殖环境、促进水产养殖业健康发展均具有重要意义。参考文献：常青,梁萌青，王家林,孙静.2006.壳聚糖对花鲸生长和非特异性免疫力的影响J.海洋水产研究,27(5)：17-22.ChangQ,LiangMQ,WangJL,SunJ,2006.Influenceofchitosanonthegrowthandnon-specifici

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