长期施氮对马铃薯田土壤剖面硝态氮积累及细菌群落结构的影响.docx

1、甘肃农业大学学报JOURNALOFGANSUAGRICULTURALUNIVERSITY长期施氮对马铃薯田土壤剖面硝态氮积累及细菌群落结构的影响张健，董星晨，张鹤，邓德雷，罗超越，张春红，邱慧珍甘肃农业大学资源与环境学院，甘箫省干旱生境作物学更点实验室，甘肃兰州730070）摘要：【目的】揭示长期连续施氮对半干旱地区马铃薯田土壤剖面中硝态氮积累及细菌群落结构的影响.防法】通过大田试验设置了6个不同的施氮水平：N。不施氮，对照）、Nm施氮里75kg/hm'）、Nm°确氮星150kg/hm2）、N2"施氮225kg/hm2>*N300施氧量300kg/hm2）和N

2、3?s施氯鼠375kg/hm2），研究连续4年施氮对旱地马铃茗田土壤剖面中硝态氮的积累以及细菌群落结构的影响.黯果】随若施氮里增加，0100cm土壤剖面内NOS_-N含量显著增加PV0.05），尤其020cm土燃表层各施氮处理的NO4_-N含里分别比对照N。增加了55.8%，】13.9%,162.8%，365.1%和988.4%.Miseq高通量测序结果显示，连续施氮显著改变了020cm表层土壤的细菌群落结构，在门水平上的土壤优势细菌类群中，随若施氮里增加，各施氮处理土壤放线菌门和拟杆曲门的细菌的丰度分别比对照N0处理增加了6.1%17.4%和16.4%46.8%，酸杆菌门的丰度比对照降低了7

3、.8%26.4%:在纲水平上的土壤优势细菌类群中，与对照N“相比，各施氮处理拟杆菌纲细菌的丰度增加了33. 8吟173.3%AciTbbacterGp4和Anaerolineae的相对丰度分别降低16.3%33.8%、8.1%22.7%：在属水平上的土壤优势细菌类群中，各施氮地理的Ohtaekwangia和Streptomyces细菌的丰度分别比对照增加了33.6%173.1溷3.4%66.4%，而Gaiella和Solirubrobacter细菌的丰度分别比对照No降低了6.9%30.8%和4. 5%27.6%.连续4a过量施氯也显著降低了土壤细菌的群落多样性.RDA冗余分析及相矣性分析结果

4、表明，土壤NO3-N含宣与放线菌门、拟杆菌门、拟杆菌纲'Ohtaekwangia'Streptomyces牺霉菌届）和Lysobacter常杆健属）的细菌的丰度显著正相失，与酸杆菌门、Gaiella'SolirubrobacterCt壤红杆蕙属）、Gemmatimonas隽单胞菌属）的细茵的丰度显著负相关.陆论】连续4a施氮，随着施氮量增加显著地提高了土壤剖面中硝态氮的含量，与对照No相比，020cm表层土壤细菌丰度随若施氮箜培加显著培加，细菌群落结构发生改变，且过箜施氮降低了土壤细菌的多样性.RDA分析及person相尖性分析表明，长期施氮引起土壤硝态氮含皇的变化是造

5、成土邃细笛群落结构发生改变的主效土壤环境因子.关键词：NO-N含五：细菌Alpha多样性：细菌群落结构：相关性分析中图分类号：S154.3文献标志码：A文章编号：100A43152019）01-0030_12DOI：10.13432/ki.jgsau.2019.01.005Effectoflong-termnitrogenapplicationonbacterialcommunitystructureofpotatosoilinsemi-aridareaZHANGJian»DONGXing-chen，ZHANHe，DENGDe-lei»LUOChao-yue*ZHANGCh

6、un-hong，QIUHui-zhenCollegeofResourcesandEnvironmentalSciences，GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience，GansuAgricultura1University.Lanzhou730070,China）Abstract：Objective】InordertoannounceNO3-Naccumulationinsoilprofileofpotatofieldindrylandandtheeffectofbacterialcommunitystructureundercontinuousnit

7、rogenN）fertilizeapplication第一作者：张健，硕士研究生.E-mail：1148126151通信作者：邱菽珍.教授，博士生导脚.主要从事桓物营养与营养生态的教学与科研工作.E-mail：hzqiu基金项目：国冢至点基础研究发展计划。73计划&015CB150501）：国冢公益性行业&业）科研专项&01103004）.收稿日期：2018-03-28：修回日期：2018-04-21多样性降低&.闭，使得土壤细菌群落结构发生变化，在本研究中，连续4a施氮，相比于其他地理，仅M”处理shannon指数显著低于其他施氮处理，而simpson指数显著

8、高于其他处理，同时最高施氮量处理N睥的土壤样品OTU与Chaol值最低，说明长期过星施氮可以降低土壤细菌多样性，该结果与前人的研究结果一致.有研究表明在美国的长期N投入试验中观察到，高N施入增加了丰富类群变形菌门和拟杆菌门）的相对丰度，降低了贫瘠类群酸杆菌门）的相对丰度血.在土攘营养物质增加时，丰富类群能利用有效碳源快速生长，因此可以在较高氮含星的环境下较好的生长繁殖，而贫瘠类群在环境中生长速度较低，吸收营养物质的能力较弱，因此在营养物质较高时，这些贫瘠类群与丰富类群相比竞争力较弱，不能良好的生长繁殖如），导致其数量下降.本研究结果表明，连续4a施氮，各处理优势菌门的绝对星发生了变化，与N。相

9、比，在020cm土层内.土壤放线菌门和拟杆菌门的丰度随着施氮星增加显著提高，酸杆茵门的丰度显著降低，土壤变形菌门丰度随着施氮量增加虽整体呈上升趋势，但各处理之间并没有显著性差异.这与前人研究结果一致，由于长期施氮导致土壤硝态氮含星显著增加，土壤营养物质增加，从而促进了丰富类群的生长，抑制了贫瘠类群的生长.有研究报道&汨变形菌门中许多细菌类群参与了土壤氮素循环，与硝化作用有关的细菌大多数属于变形菌门中的变形菌纲和l变形菌纲，而许多不同种类的细菌都具有反硝化功能，如放线菌门，厚壁菌门，拟杆菌属以及变形菌门中的一些细菌瑚，在本研究中，施氮明显促进了广变形菌纲细菌类群的生长，且检测出来的两种优

10、势属水平的菌群Lysobacter溶杆菌属）、SteroJDobacter曾杆菌属）、均属于r-变形菌纲,Nilrospira硝化螺菌属）的丰度随着施氮量增加而升高，值得注意的是，检测出来的Azotobacter固氮菌属）虽说丰度较低，但是相比施氮处理，不施氮处理中Azotobacter的丰度是施氮处理的1.2A2.15倍.说明不施氮处理显著刺激了土壤Azctobacter的生长.氮素的添加能够促进土壤放线菌门细菌的生长如），本研究发现排名前12的优势属中，有6个优势属分别是NocaiDioiDes斐诺卡氏菌属）、Gaiella、Arthrobacter箔杆菌属Strep-tomyces遂霉菌

11、属）、Solirubrobacter吐壤红杆菌属）、Blastococcus等属于放线菌纲，其丰度占整个优势属丰度的41.88%其中NocaOoiDes>Ar-throbacter都能将土壤中的硝酸盐还原为亚硝酸盐商，且随着施氮星增加，其丰度显著升高.而拟杆菌门的丰度整体来说是随着施氮星下降的，但检测出来的优势纲BacteroiDetesincrete拟杆菌纲）以及Ohtaekwangia的丰度均随着施氮量升高显著升高，Ohtaekvangia是新发现的属于拟杆菌门噬纤维菌科中的新属心，其具体的生活习性鲜见报道，因此，推测拟杆菌门中的BacteroiDetesincrete以及Ohtae

12、kwangia的细菌与反硝化作用密切相关.Gemmatimonals芽泡单菌门）中细菌类群具有很强的反硝化功能，GemmatimonaDates芽单胞菌属）具有脱氮的功能'但本研究结果中与前人研究结果相悖队2盘的是随着施氮星增加，Gemmati-monaDales的丰度显著降低，前人研究结果表明，水氮一体的环境条件下GemmatimonaDates的丰度随着施氮量增加而显著增加，因此推测，Gemmatimo-naDates对土壤水分的敏感程度较高，而在旱地土壤中，由于水分不足导致GemmatimonaDates随着施氮星升高反而呈降低趋势.值得注意的是，随着施氮呈增加而增加的细菌优势属

13、还有Lysobacter溶杆菌属）和Streptomy-ces）链霉菌属，而溶杆菌属细菌可以抑制一些土传真菌病害，如水稻白叶枯病、辣椒疫病，对立枯丝核菌具有明显的抑制作用溢：而链霉菌属细菌可以产生抗真菌活性，抗细菌活性以及抗病毒的毒素s，在本研究中，可能是由于连作和长期施氮，导致一些对马铃薯生长有害的细菌或真菌大量繁殖，刺激了落杆菌属和链霍菌属的生长.3.3细菌群落结构与部分土壤理化性质的相关性分析长期施氮显著影响了土壤细菌群落组成结构，RDA分析表明，长期施氮引起的土壤硝态氮含虽和土壤pH变化是影响土壤细菌群结构变化的主要环境因子，这与相关性分析结果一致，然而，大多数细菌都生活在pH为49的

14、环境中，且大多都能承受pH在01个单位之间的变化量而本研究发现随着施氮量升高，土壤pH相比于其他处理仅在最高施氮星处理条件下降低了0.3个单位，因此确定了引起土壤细菌群落结构变化的最主效土壤环境因子是NO3-N含呈，而并非土壤pH值.随着施氮呈升高，土壤no3-n含星显著升高，与NO.广-N含量显著负相关的菌群有Ac-iDobacteria酸杆菌门）'GemmatimonaDctcs芽单胞菌门）,AciIRbacteriaGP6、AciI3obacteriaGP4»Gemmatimonas芽单胞菌属）>Solirubrobacter（土壤红杆菌属）：这是由于酸杆菌门属于

15、贫瘠类群的，在较高的营养环境中生存竞争力不如像放线菌门，拟杆菌门这种富营养类群，所以在较高营养环境下反而不利于其生长繁殖.但是与前人研究结果不一致x25的是GemmatimonaI3etes及Gemmatimonas的丰度与土壤硝态氮含呈显著负相关.与硝态氮含宣显著正相关的细菌类群有BacteroiDetes拟杆菌门）、BacteroiDetesincertaesdl>s（拟杆菌纲）、Arthobacter节杆菌属Nocaii>oil>s偻诺卡氏属）、Ohtaekwangia'Streptomyces魅零菌属），Ly-sobacter箔杆菌属），其中BacteroiD

16、etes、Bacte-roiDetesineertaesd>s、Arthobacter、NocarDioiDBs被证实均与反硝化作用有矣，可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐，因此长期施氮导致土壤硝态氮含量升高，进而影响了土壤细菌群落结构的变化，而Streptomy-ces,Lysobacter也随着施氮虽的升高而升高，可能是因为长期施氮和连作引起的.4结论连续4a施氮显著提高了土壤剖面中硝态氮的含虽，随着施氮量升高，土壤剖面中硝态氮含量显著增加,尤其在020cm土壤中各施氮处理各处理土壤NO3_-N含虽分别为4.3,6.7,9.2,11.320.0,46.8mg/kg.分别比对照增加了55.8%

17、113.9%162.8%365.1蜓988.4%连续施氮显著改变了表层土壤的细菌群落结构,降低了土壤细菌的群落多样性.连续四年施氮，随着施氮虽的增加各陞理的门的绝对虽发生了变化，随着施氮量增加，各施氮地理土壤放线菌门和拟杆菌门的细菌的丰度分别比对照N地理增加了1%-17.4%和16.4%46.8%酸杆菌门的丰度比对照降低了7.8%26.4%在纲水平上的土壤优势细菌类群中，与对照No相比，随着施氮量增加，各处理拟杆菌纲细菌的丰度分别增加了33.8%44.8%83.3%109.2%173.3%而AcilJobacte-rGp4和Anaerolineae随着施氮呈增加显著降低PV0.05）,较No相

18、比，随着施氮量增加，各处理AciD:）bactcrGp4和Anaerolineae相对丰度分别降低16.3%33.8%8.1%22.7%：在属水平上的土壤优势细菌类群中，各施氮处理的Ohtaekwangia和Streptomyces细菌的丰度分别比对照增加了33.6%-173.1%和3.4%66.4%而Gaiella和Solirubrobacter细菌的丰度分别比对照No降低了6.9%30.8涵4.5%27.6%连续过量施氮也显著降低了土壤细菌的群落多样性.RDA及相矣性分析表明土壤硝态氮含量的变化是导致细菌群落结构发生改变的主要土壤环境因子.参考文献fi卢建武，邱慧珍，张文明，等.半干旱雨养

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29、expressionofheatshockproteins607090>andA2inrabbittestisj.Cell&TissueResearch，2011,3440):355-363.成任编辑李辛)insemiaridareas.LlethodJWesetupsixdifferentlevelsofN-fertilizerapplicationinfieldtrials：N0NoN-fertilizer»CK)»N7s(N-fertilizer，75kg/hm2)，N®(N-fertilizer，150kg/hm2)，N225(N-ferti

30、lizer，225kg/hm')»N3o0'N-fertilizer*300kg/hm?)»N375,Sl-fertilizer>375kg/hm?)，inordertostudyN03_-Nac-cumulationinsoilprofileofpotatofieldindrylandandtheeffectofbacterialcommunitystructurebyN)fertilizeapplicationforfourconsecutiveyears.(Result1Withtheamountofnitrogenapplied*thenitr

31、ateNO3-N)contentinsoilprofileof0100cmwassignificantlyincreased.Inparticular,thecontentofNO3-Nincreasedby55.8%，113.9%，162.8%，365.1%and988.4%insurfacelayerof020cmcom-paredwithNOtreatment.Miseqhighthroughputsequencingresultsshowedthatthestructureofbacterialcommunityinthesurfacesoilof020cmchangedunderth

32、econditionofcontinuousnitrogenapplication.Withtheamountofnitrogenapplied»theabundanceofsoilActinomycetesandBacteroiDesincreasedby6.1%17.4%and16.4%46.8%comparedwithNotreatment.TheabundanceofAcilDubacterphylumwas7.8%26.4%lowerthanthatofcontrol.Inthedominantclassofbacteria»withtheincreaseofni

33、tro-genapplication，theabundanceofBacteroiDetesincretincreasedby33.8%173.3%，andtherelativeabun-danceofAclJobacterGp4andAnaerolineaedecreasedby16.3%33.8%and8.1%22.7%.Insoilbac-teriaatdominantgenuslevebtheabundanceofOhtaekwangiaandStreptomycesbacteriaincreased33.6%73.1%and3.4%66.4%，respectively，andthea

34、bundanceofGaiellaandSolirubrobacterbacteriadecreased6.9%30.8%and4.5%27.6%respectively»comparedwiththecontrolN(l.Thecommunitydi-versityofsoilbacteriawasalsosignificantlyreducedbyexcessiveapplicationofnitrogenfor4years.RDAredundancyanalysisandpersoncorrelationanalysisshowedthatthecontentofNO3_-Ni

35、nsoilwasposi-tivelycorrelatedwiththeabundanceofbacteriaofActinomyces，BacteroiDetes，BacteroiDetesincertaesd)s，OhtaekwangiaStreptomycesandLysobacter.Therewasasignificantnegativecorrelationbetweenthea-bundanceofGaiella-SolirubrobacterandGemmatimonas.fconclusionlTheNO3-Ncontentinsoilprofileissignificant

36、lyincreasedwiththeincreaseofnitrogenapplicationforfourconsecutiveyears.ComparedwiththecontrolNOtrealment*thebacterialabundanceof020cmsurfacesoilisincreasedsignificantlywiththeincreaseofnitrogenapplicationrale.Thestructureofthebacterialcommunityischanged*andexcessiveapplicationofnitrogenreducedthediv

37、ersityofsoilbacteria.RDAredundancyanalysisandpersoncorrela-tionanalysisshowedthatthechangeofnitratecontentinsoilcausedbynitrogenapplicationforalongtimeisthemainenvironmenta1factorofsoilbacterialcommunitystructurechange.Keywords：NO3-Ncontent：bacterialalphadiversity；bacterialcommunitystructure；correla

38、tionanalysis地处甘肃省中部的定西市是我国重要的马铃茗种蓍和商品薯生产及淀粉加工基地有'中国马铃薯之乡”之称是甘肃省最大的马铃薯主产区，马拎著产业已成为带动农业和农村经济发展，促进农业增效、农民增收的战略性主导产业3.然而农民为追求高产和高收益，在马铃薯种植过程中肥料投入、尤其是氮肥的投入呈持续增加，盲目施肥现象十分严重七氮肥的过量投入，不仅没有达到预期的产量，反而降低了马铃薯块茎的品质、尤其是窖藏品质&45,更为重要的是，长期大呈施氮在降低氮肥利用率的同时，导致土壤剖面中硝酸盐富集，造成严重的资源浪贾以及环境污染并且显著影响了土壤细菌的群落结构和多样性&-0

39、.±壤细菌作为主导农田土壤微生物的主要类群，可以敏感响应土壤养分含量及土壤肥力的变化.本研究设置长期定位试验研究，运用传统的土壤农化分析方法结合克隆测序以及实时荧光定量PCR等分子生态学研究手段，探讨连续4a施氮对旱地马铃薯田土壤剖面中硝态氮的积累以及细菌群落结构的影响，旨在探明长期连续施氮对土壤剖面硝态氮含虽的影响以及细菌群落结构和多样性对不同施氮量的响应机制.1材料与方法1.1试验区概况田间定位试验始于2013年4月，试验地位于甘肃省定西市安定区香泉镇N3字277'，E104°30'34"），海拔20532556m，年均温度6.9C，年降水呈4

40、00mm左右，多集中在79月.无霜期140d，80%保证率0°C的积温为2075.1°C，蒸发虽1400mm以上，属中温带半干旱气候.1.2试验设计田间试验设置6个不同施氮处理：N”对照：N75施氮虽75kg/hm2N（5o施氮呈150kg/hm?，:N225（施氮量225kg/hn?）：N3oo（施氮星300kg/hm2）；N375施氮量375kg/hm'）.每个堡理4次重复，随机区组排列，小区面积7.2X9=64.8m。采用宽垄双行覆膜种植模式，垄宽1.2m，垄间距0.4m，行距0.6m，株距0.2m，种植密度为8.34X10'株/hm>.每个处理

41、肥底一致，施磷量：R05225kg/hm2,施钾K20292.5kg/hm2.N肥为尿素N，46%）,P肥为过磷酸钙ROs，16%）,钾肥为硫酸钾镁虬0,24%）.供试品种为马铃茗青茗九号'.田间试验于2016年5月1日播种，10月9日收获.按照当地常规方法进行田间管理.1.3土壤样品采集在马铃著收获期采集020、2040、4060、6080、80100cm土壤样品，测定不同土层土壤硝态氮含呈.同时，对020cm表层土壤采用克隆测序以及实时定量PCR方法测定细菌的群落组成和结构.1.4测定指标及方法土壤NO3-N和NH./-N含量的测定：0.Olmol/LCaCh溶液浸提，震荡lh，用

42、流动分析仪测定.土壤pH测定：水土比为5：1，用pH计测定.土壤有机质的测定：重铭酸钾外加热法.DNA提取：利用FastDNASpinKitforSoil试剂盒MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA），按照其说明书中的步骤提取土壤总DNA.DNA提取后,分别采用微量紫外分光光度计WanodropND-1000UV-Vis）测定土壤DNA的浓度和纯度t>?60/D28o和D/D"。）.之后将其稀释10倍用于PCR模板.PCR：每个处理的4个重复DNA，采用515F/907R对细菌16SrDNA基因进行扩增，其中，正向引物515F含有12个碱基的特异Tag标签，

43、用以区分不同的土壤样品.PCR扩增体系为：25uL的TaKaRaTaqVersion2.0plusdye（TaKaRa，Dalian，China），1pL的10Pmol/L引物，2pLDNA模板，补足21pL的ddH?O至50pL反应体系，每次PCR反应均设置无菌水的阴性对照.PCR扩增条件为：94笆5min，94°C30s，25530s，272°C45s，272'C8min.获得扩增产物后，利用E.Z.N.A©.Cycle-PureKit（OMEGA»Norcross，GA，USA），利用说明书的方法对其进行纯化，溶于1OOpLElutionB

44、uffer-利用微量紫外分光光度计NanodroND1000UVVis）测定纯化后PCR产P-物的浓度.最后将所有样品等摩尔数混合，使用VAHTSNanoDNALibraryPrepKitforIlluminaNazyme，Nanjing»China）构建高通星测J序文库,质检后通过IlluminaMiseqPE250测序仪上机分析.实时荧光定量PCR：采用Bio-RadCFX96OpticalReal-TimePCRSystem姑io-Rad，Hercules*CA.USA）扩增仪进行实时荧光定虽PCR分析.标线取自基因代表性克隆重组质粒的10倍稀释样，稀释梯度6到8个，空白样品的

45、模板为水.然后根据标准曲线的浓度计算出样品中的基因拷贝数，最后以每克干土中的基因拷贝数为单位进行分析，每个样品3次重复.定垦PCR的反应体系为20业，包括1|jLDNA模板、10|jLSYBRPremixExTaqSaKa-Ra，Dalian，China），正向和反向引物分别为0.25yL<10umol/D和8.5业的灭菌双蒸水.优化后的PCR程序如表1.表1本研究所用的引物和条件Table1Primersandconditionusedinthisstudy引物名称Primername引物序列任一3')目标基因PCR程序PrimersepuenceTargetgenePCRPr

46、ocedure515FGTGCCAGCMGCCGCGG90.95C，3min:39XQ5'C，30s;55P，30s：?：cterial1672,30swithplateread)：Meltcurve65.07RCCGTCAATTCMTTTRAGTTTto95.0'C，increment0.5°C，5s+platereadFF390CGATAACGAACGAGACCTFR1AICCATTCAATCGGTAIT2结果与分析2.1长期施氮对土壤剖面中硝态氮SL03-SI含量的影响马铃薯收获期土壤剖面各土层中NO广-N含屋的测定结果如表2所示：连续4a施氮，导致0100cm

47、内土壤剖面中NO3-N含量随着施氮虽增加显著增加PV0.05),尤其在020cm土壤样品中，各处理土壤NO3-N含虽分别为4.3、6.7、9.2、IL3、20.0、46.8mg/kg，各施氮地理的NO3_-N含呈分别比对照No增加了55.8%、113.9%、62.8%.365.1%和988.4%:在各土壤剖面内No3-n含量也不相同，随着土壤剖面深度增加，其Fungal18SrRNAgene95*C，3min:39X05C，30s：55C，30s;72*CIminwithplateread)：Meltcurve65.0to95.0,C»increment0.5*C，5s+plater

48、ead含虽逐渐降低.2.2长期施氮对表层土壤理化性质的影响表2不同施氮量土壤含量地理Treatment土壤剖面/cmSoilprofile02020404060608080100No4.3±l.51c2.8±0.21d1.4+0.23d1.3±0.431.4+0.39cn756.7±0.97dv3.3±0.2T2.5+0.19d2.9+0.23"2.7+0.18cN|5o9.2±0.8。"4.0土0.263.5±0.70"4.1±0.68"4.9±1.18N2251

49、1.3±1.36°7.1±0.49*7.9+2.or5.3+0.15C6.6+1.16cN3OO20.0±4.52h15.2±1.66b12.7±0.77"11.5±2.21b10.8±1.3511n3T546.8±5.04*32.8+0.8T21.5±5.47"18.4+0.81"M.9土1.43Table2SoilNOj-Ncontentwithdifferentnitrogenratesng*kg-')表3不同施氮处理的部分表层土壤理化性质处理Trea

50、tment土邃理化性质PhysicalandchemicalpropertiesofsoilpHNO-NNH/+-NOMNn8.29土0.04讣4.3±1.51*0.87±0.04°16.74±0.45N8.36+0.05*6.7±0.97de0.84±0.03“16.02+0.18*N|S08.29±0.02ab9.2±0.80"1.17±0.05°18.15±1.014N22S8.23土0.03b11.3±1.36°1.0410.04"16.

51、63±0.79'N30Q8.23+0.0T20.0±4.52b1.05+0.07"16.60+1.24,N37S8.02±0.04e46.8±5.04°1.05±0.02°17.49±0.94Table3Physicalandchemicalpropertiesofsoilstreatedwithdifferentnitrogenrates连续5a不同施氮呈，随着施氮量增加，土壤pH表现为先增加后降低的趋势，在N伯处理中达到最大值为8.36,在Na”处理达到最低&02,与Nu相比降低了0.

52、26,说明长期过量施氮会造成土壤pH降低.NH,-N的含虽并未随着施氮量增加而出现有规律的变化.通过对土壤OM含量的测定结果分析发现，各魁理土壤OM含量均未达到统计学差异水平,但是N,耻处理的土壤OM含呈为18.15g/kg，明显要高于其他处理.因此，在合理的施氮范围内，长期施氮可以增加土壤OM的含量.2.3长期施氮对细菌Alpha多样性的影响根据高通量测序结果，表3中列出了各处理土壤样品中在相似性0.97条件下得到的Alpha多样性指数，其中OTU和Chaol指数是表征群落丰富度的指数，OTU越高，代表物种种类越多»Chaol11越大，物种丰度越高:Shannon和simpson指

53、数是表征微生物多样性指数.shanon指数越大，物种多样堡理Treatment覆盖度Coverage丰富度Richness多样性DiversityOTUChaoSimpsonShannonNo0.9513±0.017,2460±434a3521+363'*0.0037+0.0006h6.65+0.13uN750.9575±0.008"2615+136"3589±880.0038土0.0006h6.61土0.04朴N|5(j0.9633+0.004"2669±74"3592±120&quo

54、t;0.0047+0.0008"6.55±0.09“N/250.9511+0.010"2434±136"3398土145"0.0045土0.0007h6.63±0.08"bN.oo0.962()±0.004"2655±236"3588±232"0.0047+0.0004*h6.59±0.05*bNg0.9568+0.009"2437+143"3402土1290.0059±0.0010"6.48+0.llb堡

55、理Treatment覆盖度Coverage丰富度Richness多样性DiversityOTUChaoSimpsonShannonNo0.9513±0.017,2460±434a3521+363'*0.0037+0.0006h6.65+0.13uN750.9575±0.008"2615+136"3589±880.0038土0.0006h6.61土0.04朴N|5(j0.9633+0.004"2669±74"3592±120"0.0047+0.0008"6.55

56、7;0.09“N/250.9511+0.010"2434±136"3398土145"0.0045土0.0007h6.63±0.08"bN.oo0.962()±0.004"2655±236"3588±232"0.0047+0.0004*h6.59±0.05*bNg0.9568+0.009"2437+143"3402土1290.0059±0.0010"6.48+0.llb表4不同施艇虽处理的土壤细菌Alpha多样性指数Table4

57、Alphadiversityindexofsoilbacteriatreatedwithdifferentnitrogenrales呈增加了16.4%-46.8%AciDobacteria中细菌数量减少7.8%-26.4%.2.4长期施氮对细菌群落组成的影响2.4.1长期施氮对土壤门水平细菌优势类群的影响为分析长期连续施氮对土壤细菌群落结构的影响，利用meseq高通星测序及实时荧光定量PCR等微生物学研究方法对02。cm表层土壤细菌群落结构进行分析.结果如图1所示，在门水平上不同施氮处理土壤中排名前9的细菌优势类群中，Pro-teobacteria变形菌门），AciDobacteria酸杆菌门

58、），Actinobacteria放线菌门）有绝对的优势，在各堡理中占60%左右.随着施氮呈的增加各处理的门的绝对量发生了变化，在020cm土样内Actinobacte-ria放线菌门）和BacteroiDetes。认杆菌门）的丰度显著提高，SciDobacteria）酸杆菌门的丰度显著降低，相比于Nn处理，各堡理中Actinobactcria细菌数量增加6.1%I100908070.60¥5040302010111111*6. 4%.BacteroiDetes中细菌数性越高，simpson指数越大，物种多样性越低.随着施氮虽增加，各地理仅在N375魁理土壤样品中，shannon指数显

59、著低于其他施氮处理，而simpson指数显著高于其他处理，虽然各堡理OTU与Cha01指数虽没有显著性差异，但相比其他处理，N375堡理的土壤样品OTU与Chaol值最低，这说明过虽施氮可以降低细菌的多样性.2.4.2长期施氮对土壤优势纲细菌类群的影响为了进一步分析长期施氮对土壤细菌群落结构的影响，对不同处理在纲水平上优势细菌类群进行统计分析，结果如图2所示，在纲水平上不同施氮魁理土壤中前12个优势菌群中，放线菌门中的Acti-nobacter，酸杆菌门中的AciTJobacterGp6以及变形菌纲中的Betaproteobacteria&变形菌纲）、Gam-maproteobacte

60、ria&变形菌纲）和Alphaproteobac-teria&变形菌纲）占绝对优势，在各魁理中占总优势菌纲的40%左右.随着施氮量增加，拟杆菌门中的BactcroiEtetesinceratesd>s似杆菌纲）和Acti-nobacter仿攵线菌纲）细菌的丰度显著增加（P<0.05），与对照N。相比，随着施氮量增加，各处理拟杆菌纲细菌的丰度分别增加了33.8%、44.8%、83.3%109.2%173.3%而AciDobacterGp4和Anaerolineae随着施氮量增加显著降低0V0.05）,较No相比，随着施氮量增加，各处理Ac-iDobacterGp4和A