鹅源H5N1亚型禽流感病毒对SPF雏鸡血液免疫功能的影响.docx

1、2011年】2月JournalofNortheastAgriculturalUniversityDec.2011鹅源H5N1亚型禽流感病毒对SPF雏鸡血液免疫功能的影响郑世民】，王滨坤2,高雪丽】，刘超男】，刘明3,吕晓萍】(I.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨I5OO3O：2.上海恒丰强动物药业有限公司，上海201620；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨150001)摘要：以21日龄SPF雏鸡为实验动物，应用知胞培养和免疫酶技术，通过外周血液免疫球蚩白(Igs)含量、T和B淋巴细胞数量及其增殖功能的检测.枝全面系统的研究,了鹅源H5N1亚型中强毒禽流感病毒(A】V)感染SPF站鸡后

2、，其外周血液上述被检指标的动态变化。结果表明，鹅源H5N1亚型中强毒AIV感染SPF维鸡后，其血清IgG和IgA含量在14d显著或极显著低于对照雏鸡(P<0.05或PvO.Ol),并分别于82Id和58d显著高于对照雏鸡(P<0.05或PvO.Ol);而IgM在病事感染后4d开始升高，58d明显高于对照维鸡。血液T淋巴细胞数量于病毒感染后114d显著低于对照雏鸡(P<0.05或P<0.0I),B淋巴细胞在314d明显降低(P<0.05或P<0.01)；T、B淋巴细胞对ConA或PMA的增殖反应分别于314d、38d明星低于对照雏鸡(P<0.05或P&l

3、t;0.0】)。表明AIV感染21日龄SPF雏鸡后的早期，其外周血液无论是细胞免疫还是体液免疫功能均降低,关键词：H5N1亚型禽流感病毒；SPF雏鸡；血液；T、B淋巴细胞数量及其功能；免疫球蛋白含量中图分类号：S852.56文献标志码：A文章编号：1005-9369(2011)12-0069-05InfluenceofH5N1avianinfluenzavirusfromgoosetoimmunefunctioninbloodofSPFChickens/ZHENGShimin1,WANGBinkun2,GAOXueli1,LIUChaonan1,LIUMing3,LVXiaoping1(1.C

4、ollegeofVeterinaryMedicines,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.ShanghaiHengfengqiangAnimalPharmaceuticalCo.Ltd.,Shanghai201620,China;3.HarbinVeterinaryResearchInsititute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150001,China)Abstract:Thedynamicchangesoftheimmunoglobulins(Igs)conte

5、nt,thenumberandfunctionofT、Blymphocytesinperipheralbloodof21day-oldSPFchickensinfectedwithH5N1subtypeavianinfluenzavirus(AIV)fromgooseweredetectedbyusingcellularcultureandimmunoenzymetechniques.TheresultsshowedthatcontentofIgGandIgAinserumofchickensinfectedwithAIVweresignificantlyorverysignificantly

6、lowerthanthecontrolchickensinpostinfection(PI)1-4days(P<0.05orP<0.01),andweresignificantlyhigherthanthoseofthecontrolchickens,respectively,inPI8-21daysand5-8days;andIgMcontentbegantoincreaseinPI4days,wassignificantlyhigherthanthatofthecontrolchickensinPI5-8days.ThenumberofTlymphocytesinperiphe

7、ralbloodofchickensinfectedwithAIVwassignificantlylowerthanthecontrolchickensinPI1-14days(P<0.05orP<0.01).ThenumberofBlymphocytesdecreasedsignificantlyatPI3-14days(P<0.05orP<0.01).TheproliferationresponseofT,BlymphocytestoConAorPMAreducedmarkedlythanthecontrolchickens,respectively,atPI3-1

8、4days,3-8days.Theseresultsindicatedthattheeithercellimmunityorhumoralimmunityinperipheralbloodof21-day-oldSPFchickensinfectedwithH5N1AIVshowedacertaininhibition.收稿日期：2011-01-24基金项目：黑龙江省自然基金(C20084I)作者简介：郑世民(1959-),男.教授，博士生导师，研究方向为动物免疫病理学。E-mail:zhengshiminblKeywords:H5N1avianinfluenzavirus;SPFchicke

9、n;blood;numberandfunctionofTandBlymphocyte;immunoglobulincontent禽流感(Avianinfluenza,Al)是一种急性热性接触性传染病"I,流行范围很广，尤其近年AI疫情呈现上升趋势，给主要养禽国家造成巨大经济损失叫自上世纪90年代香港禽流感事件以来叫AI的公共卫生学意义发生了质的改变，AI不但得到广大学者的关注，而且已引起了包括联合国在内的世界各国政府的高度重视。纵观对AI已有的研究资料，主要集中在病原学、流行病学、特异性诊断、DNA序列分析和疫苗研制等方面A”。在宿主抗AIV免疫反应机制方面，只见于人和小鼠的少量报道

10、咿，对SPF雏鸡感染A1V后外周血液体液免疫和细胞免疫变化的全面系统研究尚未见报道。因此，本项目以21日龄SPF雏鸡为研究对象，应用细胞培养技术、免疫酶组织化学等方法，对AIV感染21日龄SPF雏鸡外周血IgG、IgM和IgA含量.T、B淋巴细胞数量及其对ConA或PMA的增殖反应进行了较全面系统的检测，旨在为进一步探讨流感病毒的免疫致病机制，为其兽医临诊综合防治提供重要的参考依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实脸动物21日龄CSIRO-MVS品系SPF雏鸡70只，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供并饲养。1.1.2禽流感病毒(A1V)鹅源H5N1亚型AIV中强毒株，血

11、凝价为26,由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室提供，并监督使用。1.1.3主要试剂酶标羊抗兔IgG结合物(HRP-SARIgG),北京中山生物制品公司产品；兔抗鸡IgG、妁、IgA血清(RACIgS),本研究室制备；刀豆蛋白A(ConA)、乙酸豆寇佛波醇(PMA)、RPMH640完全培养液和四甲基偶氮哇盐(MTT)均为Sigma公司产品，按实验要求配成相应使用液，4无保存备用。1.2方法1.2.1实验动物分组及处理70只SPF雏鸡随机分为AIV感染组(简称I组)和对照组(简称C组)，每组35只锥鸡。其中I组雏鸡经点眼、滴鼻和口感染1：】00稀释的AIV稀释液O.lmL只气C组

12、雏鸡经上述相同途径给予高压消毒的0.01mol-L-1PBS0.1mL-R',两组雏鸡分别饲养于禽病感染实验室的负压隔离器内，严格按照高致病性禽流感实验要求和SPF动物饲养规程饲养管理。1.2.2被检材料两组雏鸡分别于AIV感染后1、3、4、5、8、14和21d,每组随机抽取5只雏鸡，心脏采血2mL供外周血液T、B淋巴细胞数髭及其增殖功能检测，然后心脏采血处死雏鸡，收集0.5mL血清供IgG、gM、IgA检测用。1.3检测指标与方法1.3.1外周血液T、B淋巴细胞数量测定采用免疫SPA菌体花环法。1.3.2 血清IgG、IgM、IgA含量测定采用间接酶联免疫吸附试验(Indirecte

13、nzyme-linkedimmuncsor-bentassay,iELISA)法。1.3.3 外周血液T、B淋巴细胞增殖功能测定133.1淋巴细胞悬液制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r-min-*,20min)分离淋巴细胞，再用RPMI1640培养液离心洗涤(1500r-min-1,10min)淋巴细胞3次，台盼兰拒染法检测细胞活率95%,并进行细胞计数，用RPMI1640完全培养液调细胞浓度至2x10,个-mL-'o1332T、B淋巴细胞增殖功能测定细胞培养及MTT法96孔微量培养板，每孔加入50皿，含ConA(80jjtg-mL-1ConA)或PMA(

14、1200ng-mL-*PMA)的RPMI1640完全培养液，对照孔只加RPMI1640完全培养液，再加淋巴细胞悬液50nL,培养物总体积为100aL,细胞终浓度为1X10,个mLL刺激孔的ConA、PMA终浓度分别为40、600ng-mL',对照孔无ConA或PMA,每组设3个重复。细胞培养板置40Y、5%C()2、饱和湿度条件下培养21h。然后每?L加5mgmLTMTT溶液10皿，再继续培养3ho每孔加入10%SDS-0.01moI-L-*HC1溶液100jjlL,置细胞培养箱中8h,然后取出以空白孔调零。测定每孔0D知的0D值，结果以淋巴细胞转化率表示。T、B淋巴细胞转化率=Con

15、A或PMA刺激孔平均0D值/X寸照孔平均0D值1.4数据处理应用Minitab软件进行数据统计处理，经检验分析组间差异。2结果与分析AIV感染21日龄SPF雏鸡血液体液免疫功能变化2.1.1 AIV感染21日龄SPF雏鸡血清免疫球蛋白含量的动态变化21日龄SPF雏鸡感染AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后14d明显低于对照雏鸡（P<0.05或P<O.Ol）,第5天后开始逐渐升高，821d显著高于对照雏鸡（P<0.05或P<0.01）；【gM含量于第4天开始增加，58d显著或极显著高于对照雏鸡（P<0.05或P<0.01）；而IgA含址在病毒感染后4d内显著

16、降低（P<0.05或PvO.Ol）,58d病毒感染雏鸡较对照维鸡明显增加（P<0.05）,其余未见统计学差异（见表1）。2.1.2AIV感染21日龄SPF雏鸡外周血液B淋巴细胞数量及其对PMA增殖功能变化21日龄SPF雏鸡感染AIV后，其外周血液B淋巴细胞数量除第1天明显高于对照雏鸡（PvO.05）外，314d均显著或极显著（P<0.05或PvO.Ol）低于对照雏鸡；B淋巴细胞对PMA的增殖反应于病毒感染后38d明显减弱（P<0.05或PcO.Ol）,其他除第1天外，其余尽管病毒感染雏鸡较对照雏鸡增加，但未见统计学差异（己>0.05）（见表2）。项目天数Dayhe

17、m34581421IgGC1.36±0.0281.51±0.027l.56±0.0841.59±O.O76l.56±0.0391.55±0.074l.54±0.042I1.22±0.082*1.32±O.O47*l.43±0.074*1.60*0.0311.72±0.088»*1.67±0.095*l.64±0.086»IgMC1.28±0.0151.34±0.09!1.35±0.0021.3910.0861.34&

18、#177;0.076l.39±0.08l1.46±0.087I1.26±0.0571.28±0.0071.39±0.0341.49±0.038*l.53±O.O15”】.4810.1091.43±O.O15IgAC1.29±0.005l.52±0.0411.58H.OOI1.53±O.O651.53±O.O3Ol.49±0.0521.57±0.063Il.ll±0.076”1.32±O.O33”1.44±0.038*1.64&

19、#177;0.048*1.64±0.094*i.50±0.0881.59±0.045Table1Changesoftheimmunoglobulin(Igs)contentinserumof21-day-oldchickensInfectedwithAIV注:C-对照组,1-AlV感染组；*表示差异显著P<0.05,，*表示差异极显著R0.01.无衣示者差异不显著/*>0.05;T同。Note：Q)Ccontrolgroup.I-groupinfectedwithAIV;ThevaJuenwithasteriskdiffersignificantly(

20、withsingleasterisk,P<0.05)orverysignificantly(withdoubleasterisk,户vO.Ol)andviseversa.Thesameasbelow.表1AIV感染21日龄SPF雏鸡血清免疫球蛋白含量变化表2AIV感染21日龄SPF雏鸡血液B淋巴细胞数量及其增殖反应变化Table2ChangesofthenumberandproliferativeresponsestoPMAofBlymphocytesinbloodof21-day-oldchickensinfectedwithAIV项目Item天数Day134581421数址C4.39

21、±0.885.60M.395.80±0.416.50±0.696.82±0.897.09t0.416.54±0.37Number15.78±0.44*3.12±O.O2“3.52±0.69"5.50±0.56*5.46±0.38"5.87±O.23“7.0410.46功能C1.50±0.08.36*0.071.13±O.O71.17±O.O51.2O±O.O81.23±0.110.99±0.03Functi

22、onI1.67*0.08*1.15±O.O2”1.00±0.05"1.01±0.02"l.O3±O.O9*1.26±0.09l.08±0.08注:B淋巴细胞数般单位是106个51：；功能为刺激指数。Note:UnitofBlymphocytesnumberis10*celbmL'1;functiona)unitsforthestimulationindex.22AIV感染SPF雏鸡外周血液细胞免疫功能变化21日龄SPF雏鸡感染AIV后l14d,其外周血液T淋巴细胞数量较对照雏鸡显著或极显著减少（P<0

23、.05或P<0.01）;T淋巴细胞对ConA的增殖反应于病毒感染后314d明显降低（P<0.05或P<0.01）,其余未见统计学差异（见表3）o表3AIV感染21日龄SPF雏鸡血液T淋巴细胞数量及其对ConA增殖反应变化Table3ChangesofthenumberandproliferativeresponsestoConAofTlymphocytesinbloodof21-day-oldchickensinfectedwithAIV项目hem天数Day134581421数址C5.78±O.2I7.65±0.248.46±0.!78.48*0

24、.4610.05±0.847.09±0.419.3010.89NumberI4.41±0.29*5.48±0.46*5.78±0.74*6.8910.36*6.99±0.40*5.87±0.23"8.50±0.78功能C1.4310.041.22±0.051.24±0.051.21±0.07l.O3±O.O81.23±0.11l.O3±O.O8FunctionI1.39±O.O50.95±0.0r*0.68±0.09

25、*0.92±0.10»*0.92±0.04*0.97±0.05*O.94±O.O8注:T淋巴细胞数量单位是I。个-mL1;功能为刺激指数。Note：UnitofTlymphocytesnumberisIO6cell,mL"1;functionalunitsforthestimulationindex.3讨论本研究应用细胞培养技术和免疫酶组织化学方法对21日龄SPF雏鸡人工感染鹅源H5N1亚型中强毒AIV后,其外周血液的IgG、IgM、IgA含量，T、B淋巴细胞数届及其对ConA或PMA增殖功能的动态变化进行动态检测，结果发现，21日龄

26、SPF雏鸿感染H5N1亚型AIV后，其血清IgG含量于病毒感染后14d明显低于对照雏鸡，随后开始逐渐升高;IgM含量于58d显著或极显著高于对照维鸡；而IgA含量在病毒感染早期显著降低，58d较对照雏鸡明显增加。外周血液B淋巴细胞数扯于病毒感染后314d显著或极显著低于对照雏鸡；B淋巴细胞对PMA的增殖反应于病毒感染后38d明显减弱。表明AIV感染雏鸡外周血液的体液免疫功能受到一定程度抑制°据报道叫，鸡自然感染AIV后第3天已有HA特异性抗体的产生，并且可维持较高水平。在抵御流感病毒感染中，以B淋巴细胞为主的体液免疫发挥了十分重要的作用。B淋巴细胞在致敏Th细胞及其分泌的某些细胞因子

27、(如IL-1、B细胞生长因子、B细胞分化因子、IL-2等)作用下，分化发育为浆细胞，分泌T细胞依赖性(TD)ft体。Walter等研究发现叫T淋巴细胞缺陷小鼠流感病毒感染后也可诱导抗体反应，表明流感病毒可不依赖于T细胞辅助抗体应答，称为T细胞非依赖性(TI)抗体应答，该抗体通常只产生IgM型抗体，而且不发生抗体类别转换，且无记忆反应。进一步研究表明，上述两种抗体均能在一定程度上降低流感病毒感染动物的死亡率，但TD抗体对机体的保护比TI抗体更有效时。Kostolansky等试验发现叫，小鼠自然感染AIV后，可引起强烈的抗HA2抗体应答，表明AIV的HA2可诱导机体产生清除病毒的抗体。本研究还发现

28、，21H龄SPF雏鸡感染AIV后，其外周血液T淋巴细胞不但数量较对照雏鸡显著或极显著减少，而且T淋巴细胞对ConA的增殖反应于病毒感染后314d也明显降低，表明AIV感染可显著降低SPF雏鸡外周血液的细胞免疫功能。王颖彦等报道«,感染H5N1病毒小鼠血液中CD/T、CD/T、CD/T细胞数量下降，脾脏中T细胞数量下降趋势与血液相同，AJV感染对T淋巴细胞数最影响较大，特别是CD。'淋巴细胞受损害更为明显°另有研究发现时，在AIV感染急性期T、B淋巴细胞数量均减少，但不改变CD；与CD/T细胞比率，T淋巴细胞对PHA和ConA的应答降低，表明AIV可抑制细胞免疫功能。

29、鸡、雉鸡人工或自然感染高致病性禽流感病毒后，其胸腺、法氏囊和脾脏等器官均呈现坏死性炎咋吐由于病毒感染使免疫器官发生变性、坏死，不但导致淋巴细胞数量明显减少，而且淋巴细胞对有丝分裂原的应答功能也显著降低。本项目的另一部分研究也发现网，AIV感染SPF雏鸡后，其胸腺、法氏囊和脾脏等免疫器官的T、B淋巴细胞对ConA或PMA的增殖反应在一定时间内明显下降，但两者的程度并不相同，其中T淋巴细胞对有丝分裂原的反应性较B淋巴细胞降低尤为明显。AIV感染SPF线鸡后，其外周血液的细胞免疫和体液免疫功能下降是机体免疫器官免疫功能低下的外在表现，而免疫器官免疫功能的减弱或丧失是外周血液免疫功能改变的基础或根源。

30、参考文献(1甘孟侯.禽流感M.2版.北京：中国农业出版社,2002.2SwayneDE,Pantn-JackwoodM.PathogenicityofavianinfluenzavirusesinpoultryJ.DevelopmentinBinlogicals,2006.124:61-67.(3IMuramotoY,OzakiH,TakadaA,etal.HighlypathogenicH5N1influenzavimscausescoagulopathyinchickensJ.MicrobiologyandImmunology,2006,50(1)：73-81.4Slurm-Ramirez

31、KM,EllisT,liousGeldB,rtal.R(i?mergingH5N1influenzavirusesinHongKongin2002arrhighlypathogenictoducksfj).JournalofVirology,2004,78(9):4892-4901.|5)MoIp,BrughM.Fletcher0J,etal.Comparativepathologyofchic*kensex|M*hmentallyinoculatedwithavianinfluenzaviruiu*soflowandhighpathogenicityJj.AvianDiseases,1997

32、.41(1):125-136.(6IxiX,ChoD,HallH.etal.PathogenicityandantigenicityofanewinfluenzaA(H5N1)vimsisolatedfromduckmeatJ.JournalofMedicalVirology,2003,69(4):553-559.7JLeeCWSuarezDUTumpeyTM,etal.CharacterizationofhighlypathogenicH5NIavianinfluenzaAvirusesisolatedfromSouthKorea|J.JournalofVirology,2005,79(6)

33、:3692-3702.I8)吴晓东，张海涛.人感染禽流感病毒的研究进展|J.现代预防医学.2007,34(8):1459-1460.(9王颖彦.刘忠华，张钱，等.禽流感H5N1病毒感染BALB/c小鼠的细胞免疫动态变化J.中国实验动物学报,2005(SI)：46.10罗玲,胡薛英，程国富,等.H9N2亚垠禽流感病毒人工感染蛋格的组织病理学研究(几中国预防兽医学报,2004.26(4):20-GerhardW,MozcizanowskaK.RolesofCDTandBcellsininfluenzavirusinfcctionJ.InternationalCongressSeries,2001,

34、1219:311-318.(12 MozcizanowskuK.FurvhnerM,ZharikovaD,elal.RolesofCDT-cell-independentand-dependentantibodyresponsesinthecontrolofinfluenzavirusinfection:evidencefornoncognateCfh,T-cellactivitiesthatenhancethetherapeuticactivityofantiviralantib<Klies(J.JournalofVirology,2005,79(10):5943-5951.113Ko

35、stolanskyF,MuchaV,SlovAkovdR,rtal.NaturalinfluenzaAvimsinfectionofmiceelicitsstrongantibodyresponseloHA2glycopolypeptidefj|.ActaVinilogica,2002.46(4):229-236.14 TumpeyTM,LuX,MorkenT,etal.Depletionoflymphocytesanddiminishedcytokineproductioninmiceinfectedwithahi前lyviruJcntinfluenzaA(H5N1)virusisolatedfromhuniansJJ.JounialofVirology,2000.74(13):6105-