诱导型一氧化氮合酶与动脉血压的调节

1、    诱导型一氧化氮合酶与动脉血压的调节        摘要目的：探讨诱导型一氧化氮合酶在血液动力学调控中的作用。方法：本实验所用动物为健康、雄性、Dahl 盐敏感（DS）及Dahl盐不敏感（DR）大鼠，体重(190±4) g。通过慢性血液动力学实验观察静脉输入诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂AG对大鼠平均动脉压的影响。此外，本实验还测定了一氧化氮（NO）终产物NO2及NO3含量以及钙依赖及钙不依赖的NOS活性以了解iNOS的功能。结果：（1）iNOS特异抑制

2、剂AG对正常血压（包括高盐或低盐输入的Dahl盐抵抗大鼠及低盐输入的Dahl盐敏感大鼠）没有明显影响，但能明显放大高钠引起的DS大鼠的血压上升效应；（2）高盐在导致的DS大鼠血压升高的同时，能引起iNOS活性的明显升高。结论：iNOS是参与血液动力学调控的重要组成部分，尤其是在血压处于较高水平时，iNOS具有不容忽视的调节作用。主题词一氧化氮； 血压；大鼠；氯化钠中分类号R544.1文献标示码A 文章编号1000-4718(2000)05-0397-04 Inducible nitric oxide synthase and arterial pressure regulationCHENG

3、Shao-bing, TAN Dun-yong， CHEN Xiao-lin，YANG Hao-zhuang, ZHANG Sui-mei, YAN Liang(Dept. of Pathophysiology, Jinan University Medical College, Guangzhou 510632, China)AbstractAIM and METHODS：To clarify the role of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the regulation of blood pressure，in the presen

4、t study, we examined the effect of aminoguanidine (AG), a selective inhibitor of iNOS on the hemodinamical response of Dahl salt-sensitive (DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats to low (0.3%) or high (8%) sodium chloride (NaCl) infusion by chronical in vivo hemodynamic experiment, and the effect of

5、NaCl or NaCl plus AG infusion on urinary nitrate (NO3)/nitrite (NO2), the end product of nitric oxide (NO), excretion by Greiss Reaction. Furthermore, NOS activity assay was also carried out to probe the effect of NaCl and AG on calcium-dependent or independent NOS activity in renal tissue. RESULTS:

6、1. High or low NaCl-infused DR rats and low NaCl-infused DS rats have no hemodinamical response to AG, however, the hypertensive effect of high NaCl (8%) infusion on DS rats were greatly amplified by co-infusion of AG. 2. Administration of high NaCl significantly elevated the iNOS activity of renal

7、tissue, and greatly increased urinary NO3/NO2 excretion. CONCLUSION:Inducible NOS is an important modulator of arterial pressure, especially in case of higher blood pressure.MeSHNitric oxide； Blood pressure； Rats； Sodium chloride一氧化氮（nitric oxide,NO）具有强大的扩血管作用，体内NO的合成由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NO

8、S）催化底物精氨酸（L-arginine, L-Arg）的氨基上的N与分子氧（O2）结合生成。目前已经证明至少存在3种NOS，即内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS（iNOS）及神经型NOS（nNOS）13。虽然大量的研究表明eNOS在血液动力学中具有极其重要的调节作用，但有关iNOS在血液动力学中的作用却知之甚少。我们以前的工作表明，高盐能刺激大鼠NO的生成及iNOS蛋白的明显增加，由此我们推测iNOS在维持正常血压尤其是在某些高血压因素的影响下将血压维持在一定的范围内起着极为重要的作用。本研究主要观察长期静脉给予iNOS抑制剂aminoguanidine (AG)后,对大鼠血压的影响。材

9、料和方法一、慢性在体血液动力学试验78周龄（体重190±4g）、雄性Dahl盐敏感（Dahl salt sensitive, DS）或不敏感（Dahl salt resistant, DR）大鼠，禁食（但自由饮水）1820 h，经苯巴比妥钠（60 mg/kg b w, ip）麻醉后，行腹主动脉及股静脉插管术，然后两导管经皮下自颈后部引出并与一双导管旋转活结（Swival，Instech,Plymouth Meeting,PA）相连，以使动物可自由活动而不致导管扭转打结。手术后动物恢复1星期开始实验，置于代谢笼并保持室内温度恒定、环境安静及以日光灯模仿白天/黑夜周期（12 h:12 h

10、），并随机分为8组（n=6）：DR低盐(NaCl)、DR低NaClAG、DR高NaCl、DR高NaClAG、DS低NaCl、DS低NaClAG、DS高NaCl、DS高NaClAG。动脉导管经旋转活结及压力转换器（Cobe, Lakewood,CO）后与生理记录仪（model 7D, Grass Instruments,Quincy, MA）相连，其血液动力学数据经一模/数（A/D）转换装置转换成数字信号后输入计算机处理、储存及分析。收集实验最后24 h尿液测定其nitrite/nitrate浓度。二、Nitrate/nitrite测定NO的代谢终产物尿中nitrate/nitrite（UNOx

11、）含量测定使用Greiss反应及E.coli还原酶（使NO-3还原为NO-2）。试验中所收集的尿液样品于70储存。测定时，将样品与E.Coli nitrate还原酶于37孵育90 min后离心取上清。0.2 mL上清加入0.4 mL Greiss试剂显色，并以分光光度计于543 nm波长测定并计算NO-2及NO-3总浓度4,5。三、一氧化氮合酶活性测定慢性在体血液动力学试验完毕后，大鼠经过量注射苯巴比妥钠处死后，迅速取出肾髓质并置于干冰冷冻。剪碎后以组织匀浆器匀浆，匀浆液组成：250 mmol/L sucrose, 1 mmol/L EDTA, 0.1 mmol/L PMSF, and 5 m

12、mol/L potasium phosphate, pH 7.7。 NOS分析时，将组织匀浆加入下述液体进行孵育：2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L NADPH, 25 mol/L FAD, 1.25 g/mL钙调素（calmodullin）, 10 mol/L四氢吡啶（tetrahydrobiopterin）, 及3H-L-arginine ( 300 000 counts/min, s a. 2.52×1012Bq/mmol) in 20 mmol/L HEPES buffer, pH 7.2, 于37孵育5 min。 在上述液体中加入0.5 mmol/L EDTA并

13、去除Ca2+及calmodullin测定Ca2+不依赖的NOS活性。结果一、NaCl及AG对平均动脉压的影响如1所示，盐浓度的改变对Dahl 赖盐大鼠（DR）的平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）几乎没有影响。输入0.3%及8NaCl的大鼠组，其第10 d的MAP分别为(12.28±0.17)及(12.07±0.16) kPa。在输入0.3或8NaCl的同时，输入iNOS特异抑制剂AG，其MAP亦基本无变化。但在输入0.3或8NaCl的Dahl盐敏感的大鼠，输入8NaCl后，其MAP明显升高，输入0.3及8NaCl溶液组，输入10 d后的MAP

14、分别为(12.43±0.40)及(18.83±0.13) kPa。若在输入盐溶液的同时输入AG（12.3 mg.kg-1.h-1）能显著放大高盐引起的MAP升高，输入AG后第10 d，MAP为(21.49±0.23) kPa。二、NaCl及AG对nitrate/nitrite的影响从表1可以看出，不同盐溶液输入对DR大鼠NO代谢终产物nitrate/nitrite基本没有影响。输入0.3及8盐溶液的DR大鼠，其nitrate/nitrite生成量分别为3 456±234及3 564±210 nmol/24 h。在0.3NaCl+AG及8NaCl

15、+AG组DR大鼠，其nitrate/nitrite生成量分别为3 103±212及3 098±123 nmol/24 h,说明无论在高盐或低盐情况下输入AG对DR大鼠NO生成均无明显影响。与此相反，高盐输入能明显增加DS大鼠nitrate/nitrite生成，输入0.3及8NaCl的DS大鼠，其nitrate/nitrite生成量分别为3 543±231及13 298±432 nmol/24 h。同时输入AG（12.3 mg.kg-1.h-1）几乎完全抑制高盐刺激NO生成的效应（表1）。Low NaClLow NaCl+AG Hi NaCl Hi NaC

16、l+AGDR Rats3 456±234 3 103±2123 564±210 3 098±123DS Rats 3 543±231 3 104±225 13 298±432*4 098±342#     *P0.01, vs low NaCl infused group； # P0.01, vs group infused high NaCl alone; DR： Dahl Salt-Resistent； DS:Dahl Salt-Sensitive 三、NaCl及AG对钙

17、依赖NOS及钙不依赖NOS活性的影响由于eNOS及nNOS的活性依赖Ca2+的存在，而iNOS则为Ca2+非依赖的NOS，本实验中，我们利用反应液中Ca2+、calmodullin及EDTA的有无得以测定钙依赖NOS（eNOS及nNOS）及钙不依赖NOS活性（iNOS）。 NOS活性分析表明，0.3%及8NaCl后，DR大鼠肾组织钙依赖的NOS及钙不依赖的NOS活性均基本无改变（表2）。0.3及8NaCl输入后，钙依赖的NOS的活性分别为8 650±908及8 775±678，钙不依赖的NOS的活性分别为3 455±322及4 522±302。而在DS大

18、鼠，高盐能明显升高钙依赖的及钙不依赖的NOS的活性，0.3及8NaCl输入后，钙不依赖的NOS活性分别为4 233±554及35 698±1 380。同时给予AG后则能显著抑制钙不依赖的NOS活性的升高（表2）。表2NaCl、AG对大鼠肾组织Ca2+ 依赖及Ca2+Calcium-dependent NOSCalcium-independent NOS DSDRDS DRLow NaCl6 571±786 8 650±9084 233±5543 455±322 High NaCl8 987±2 432* 8 775±

19、;67835 698±1 380*4 522±302 High NaCl+AG6 421±1 987# 7 242±90810 985±2 345#4 109±444     * P0.05,*P0.01, vs low NaCl infused rats; # P0.05, # P0.01, vs high NaCl infused rats 讨论为探讨iNOS在动脉血压调节中的作用，本实验系统观察了给Dahl盐敏感（DS）及Dahl盐不敏感（DR）大鼠长期静脉输入AG后平均动脉压的变化情况。

20、结果如1所示，DR大鼠，输入0.3及8NaCl后MAP没有显著改变。输入NaCl的同时，给予AG对MAP亦无影响。输液10 d后，DRlow NaCl及DR+High NaCl组大鼠的MAP分别为(12.28±0.17)及(12.07±0.16) kPa。但在DS大鼠，8NaCl则能显著升高MAP。DSLow NaCl及DShigh NaCl组的MAP分别为(12.43±0.40)及(18.83±0.13)kPa。若同时给予AG，能明显放大NaCl的升血压效应。给予8NaCl及AG（12.3 mg*kg-1*h-1）组大鼠的MAP由单纯给予8NaCl时的

21、(18.83±0.13)升高到(21.49±0.23)kPa。这一结果提示iNOS可能在血压升高时被激活，iNOS可能在相对较高的血压时才起作用。血压本身可能是iNOS的有效刺激因素。     iNOS最早在大鼠巨噬细胞发现，且能被细菌感染迅速激活生成大量NO以发挥其免疫杀伤作用。大量报道表明，iNOS不仅存在于免疫系统，在血管内皮细胞亦存在大量iNOS，提示iNOS对血管张力、血液动力学可能具有不容忽视的调节作用69。此外，与eNOS及nNOS不同，iNOS一旦被某种因素激活，能在很短的时间内生成高于平时上千倍的NO6,7。这一点为

22、iNOS参与高血压情况下血管张力的调节，从而使血压不再继续升高奠定了酶学基础。血管内皮细胞、肾组织等部位存在的eNOS及iNOS在血液动力学调控中可能有不同的分工。一般情况下（血压正常时），正常血管张力及动脉血压的维持可能以eNOS为主，因而Dahl盐不敏感的大鼠(DR)以及给予低盐的Dahl 盐敏感的大鼠（DS），其NO的生成相对恒定（表1），同时此时给予AG以阻断iNOS的活性，而血压并不上升（1）。但在高血压等病理情况下，由eNOS所产生的NO不足以维持血管的正常张力时，iNOS得以激活，并产生相对大量的NO以使血压不致恶性升高。从表2可以看出，在高盐刺激下，DS大鼠肾组织eNOS及iN

23、OS活性均升高，但以iNOS的升高更为明显，并可见NO合成释放大幅度升高。本工作证实，iNOS是参与血液动力学调控的一个重要组成部分。尤其是在血压处于相对较高水平时，iNOS可能起着不容忽视的作用。有关iNOS在血压较高被激活的机制、与血压之间量的关系以及其他类型的高血压与iNOS的关系等，值得进一步探讨。基金项目国家自然科学基金（No.39870359）及教育部留学回国人员科研启动基金资助程少冰（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）谭敦勇（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）陈小琳（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）杨皓庄（

24、暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）张穗梅（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）颜亮（暨南大学医学院病理生理教研室， 广东 广州 510632）参考文献1Blottner D. Nitric oxide and fibroblast growth factor in automatic nervous system: short and long term messengers in automatic pathway and target organ controlJ. Prog Neurol， 1997, 51:423438.2Taylor-Ro

25、binson AW. Counter-regulation of T-helper 1 cell proliferartion by nitric oxide and interleukin-2J. Biochem Bioph Res Commun， 1997, 233:1419.3Rees D, Ben-Ishay D, Moncada S. Nitric oxide and the regulation of blood pressure in the hypertensive-prone and hypertension resistant Sabra ratJ. Hypertension，1996, 28: 367371.4Tan DY, Cernadas MR, Aragoncillo PA,et al. Role of nitric oxide-related mechanisms in renal function in ageing ratsJ. Nephrol Dial Transplant， 1998, 13:594601.5Tan DY, M