老年期痴呆患者脑脊液微管相关蛋白tau的检测

1、    老年期痴呆患者脑脊液微管相关蛋白tau的检测        【摘要】目的探讨老年期痴呆（SD）患者脑脊液（CSF）中微管相关蛋白tau(以下简称tau)的检测方法。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测26例SD患者和30例非神经系统疾病患者的CSF-tau。结果两者浓度分别为473±279、151±60 pg/ml，有极显著差异（P<0.001）；本法灵敏度为53.8%,特异性为83.3%，检出限60 pg/ml，组内变异1.2

2、%5.9%,组间变异1.7%6.0%。结论采用双抗体夹心ELISA法检测SD患者CSF-tau的浓度可为诊断SD提供有价值的参考依据。【关键词】老年期痴呆脑脊液ELISAtau蛋白 老年期痴呆（SD）主要包括老年性痴呆（AD）和血管性痴呆（VD）。在欧美以前者多见，东方国家则以后者多见，我国尚无定论1,2。二者不同程度地存在有较多的神经元纤维缠结（NFTs）,电镜下的NFTs由双股螺旋细丝（PHFs）组成，过度磷酸化的tau蛋白是PHFs的主要成份3。这种tau释放到脑脊液(CSF)中可以用ELISA法检测到。国外近年来已开展这方面的研究并有不少报道48。为探讨SD的实验诊断方法，我们于199

3、8年6月起开展了ELISA法检测SD患者CSF-tau的研究。现将其检测方法及结果介绍如下。1对象与方法1.1对象SD组26例(其中AD14例,VD12例),年龄4978岁,平均63±10岁;对照组30例,年龄4976岁,平均62±10岁。AD诊断全部符合美国NINCDC-ADRDA的“很可能是AD”的诊断标准9，哈金斯基缺血量表（HIS）得分5分，简易智能筛查表（MMSE）得分21分;VD诊断全部符合国际上的ICD-10-F01诊断标准，HIS7分，MMSE21分；对照组30例均为非神经系统疾病手术行腰麻者，MMSE27分，头颅CT证实无脑萎缩和脑梗死者。1.2方法120

4、）包被的酶标微量滴定板；(2)冻干重组人tau蛋白标准品，用前以500 l标本稀释液稀释；(3)偶联剂I：含两种生物素化的单克隆抗人tau抗体（HT7和BT2120,液相抗体HT7和BT2，抗原为人tau蛋白。操作程序：所有试剂和标本在用前置室温平衡30 min；各种试剂按要求倍数稀释；每份CSF各取0.2 ml按12用标本稀释液稀释备用；在每一滴定孔内加入偶联剂75 l,随后加入标准品tau(标准管)、标本稀释液（空白对照管）、稀释好的标本（待测管）各25 l，使每孔反应体积均为100 l；混匀，parafilm密封，置25孵育过夜；抛干孔后洗板4次；加入偶联剂100 l，混匀，密封，25孵

5、育40分钟；抛干洗板4次；加入TMB显色液100 l，25孵育30分钟；加入终止液100 l，置酶标仪450 nm，空白孔调零后读取2次A值，取其均数为结果。依标准tau浓度梯度和相应A值求±s)表示，组间比较F检验。2结果2.1CSF tau回归方程标准孔tau和A值见表1。将表1数据代入=a+bX，得出tau的回归方程为tau=3507.88×A-40.135。表1标准管tau和A值管号123456tau(pg/ml)1200600300150750A 值0.3600.1680.8100.5300.50002.2各组CSF tau浓度见表2。 表2各痴呆组与对照组CSF

6、-tau比较(±s)组 别CSF-tau含量（pg/ml） AD(n=14)483.3±285.7*VD（n=12）461.0±288.7*SD(n=26)473.0±279.5*对照组(n=30)151.3±60.4与对照组比较*P<0.01,*P<0.001 2.3本检测的实验技术参数(1)灵敏度和特异性：以对照组tau ±2s(151.3+2×60.4=272.1 pg/ml）为界值，判断本法灵敏度和特异性分别为53.84%、83.33%。(2)检出限与回收率：以12次测试标本稀释液的平均A值+4s为检出限

7、下限，59.9 pg/ml,回收率 92.16%。(3)实验变异：组内1.2%5.9%，组间1.7%6.0%。3讨论本实验采用双抗体夹心（AT120与HT7/BT2）ELISA法检测CSF-tau抗原，所测tau为CSF总tau,包括正常微管相关蛋白tau和过度磷酸化的tau。正常情况下tau存在于神经元内，尤以轴索中丰富，其生理功能主要与胞浆或轴浆运输有关，可能的机理是通过提高微管的稳定性来实现的，而微管的一个主要作用是胞浆或轴浆运输3。正常tau与AD病人的tau（PHFs-tau）在聚合、磷酸化、微管结合和装配能力以及糖基化等方面有很大差异，后者为过度磷酸化和糖基化的tau，由于其微管结

8、合区的自我结合导致了其对微管稳定性作用的丧失，微管稳定性的丧失则导致了其运输功能的障碍，进而造成了神经纤维及神经元的变性和坏死。当神经元崩解后，tau释放到CSF中。因此，检测CSF-tau可以间接反映神经元变性、坏死和轴索崩解情况。但目前只能检测CSF总tau，尚无法单独检测过度磷酸化tau。在1998年，日本的Kanai等7人用同一种试剂盒检测了276例病人和对照者CSF，其结果为AD 489±298，VD 267±146，NC 217±128，灵敏度 40%，特异性86.0%。从Kanai资料与本资料的结果看，两组结果相近，可见本法有较好的可重复性和可靠性。

9、尽管痴呆的人口比例不断上升，人们对痴呆的认识也不断深化，但痴呆的生前诊断仍停留在临床量表水平，早期依靠客观的检测手段诊断仍很困难。我们采用双抗体夹心ELISA法检测SD患者CSF-tau可以为生前诊断SD提供一个有价值的生物学参考指标。作者单位：王琨（徐州医学院附属医院221002）沈霞（徐州医学院附属医院221002）丁新生（南京医科大学第一附属医院）程虹（南京医科大学第一附属医院）姚娟（南京医科大学第一附属医院）邓晓萱（南京医科大学第一附属医院）参 考 文 献1，高素荣主编. 痴呆诊疗学. 第1版. 北京: 北京科学技术出版社,1998.22，Kokmen E,Beard CM,O'

10、;Brein PC,et al. Is the incidence of dementing illness changing? Neurology，1994，43:18873，盛树力主编. 老年性痴呆.从分子生物学到临床诊治. 第1版.北京: 科学技术文献出版社，1998.1884，Vandermeeren M，Mercken M,Vanmeche E,et al.Delection of tau proteins in normal and Alzheimer's disease cerebrospinal fluid with a sensitive sandwich enzym

11、e-linked immunosorbant assay.J Neurol Chem，1993,61:18285，Arai H，Terajima M,Miura M，et al. Tau in cerebrospinal fluid:A potential diagnostic maker of Alzheimer's disease. Ann Neurol，1995,38:6496，Blennow K，Wallin A，Agren H，et al. Tau protein in cerebrospinal fluid: A biochemical marker of axonal d

12、egeneration in Alzheimer's disease. Mole Chem Neuropathol，1995,26:2317，Kanai M，Matsubara E，Isoe K，et al. Longitudial study of cerebrospinal fluid levels of tau、A1-40 and A1-42(43) in Alzheimer's disease: A study in Japan. Ann Neurology，1998,44:178，John Q，Trojanowski A，Christopher M，et al. Elevated levels of tau in cerebrospinal fluid:implications for the antemortem diagnosis of Alzheimer's disease.Alzheimer's Disease Review，1996,1:779，Mckham G，Drachman D，Folstein M,et al. Clinical diagnosis of Alzh