苏南丘陵区紫花苜蓿菌核病病原研究及防治初报

1、苏南丘陵区紫花苜蓿菌核病病原研究及防治初报张薇1 胡跃高1 张力群2 储国良3中国农业大学草业工程研究中心，北京1000942. 中国农业大学植病系，北京1000943. 江苏省镇江市农业科学研究所，句容 212400摘 要 本文通过对核糖体转录间隔区（ITS）序列分析，结合形态学特征对采自苏南丘陵地区的苜蓿菌核病菌NJ1进行病原鉴定，确定病原菌为三叶草核盘菌（Sclerotinia trifoliorum）。对该病原菌生物学特性研究表明，菌丝生长最适温度为1823，最适pH值为59。病原菌对硫酸铵利用能力强，对L-半胱氨酸利用能力差；对甘露醇和乳糖利用最好，D-果糖和D-木糖利用较差,不能利

2、用柠檬酸。用平皿法比较化学药剂对病原菌抑菌杀菌能力，其中根必治、速克灵和万霉净3000倍液可完全抑制病菌生长，温室生测表明根必治防效最好。从当地苜蓿根际土壤中筛选到三种有效生防细菌，平皿对峙试验中S1和S2抑菌效果较好，抑菌带达到或超过1.5cm，温室生测S2生防效果最好，防效达67.5%。关键词 苜蓿菌核病，Sclerotinia trifoliorum，ITS，防治随着苏南丘陵区苜蓿生产扩大，发生了严重的菌核病害。病原菌在田间形成可以越冬（夏）的菌核，以菌丝形态在田间大量侵染，造成苜蓿减产和品质降低。国外对苜蓿菌核病原菌生理生化特性、发病生态因子及防治方面研究较多，如1978年美国植病学会

3、举行的Sclerotinia学术讨论会上所报道的菌丝适宜生长pH值为2.591，二十多种化学药剂2和盾壳霉、木霉菌等生防菌3可以防治菌核病。我国自发现苜蓿菌核病后一直没有病原菌的鉴定报道。由于核糖体基因转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）在真菌种间存在丰富的变异，该区域的DNA酶切图谱以及序列分析为真菌分类、鉴定提供了一个强有力的工具4。基于此，Carbone和Kohn在1993年5就已经研究了核盘菌科（Sclerotiniacceae）核糖体DNA的ITS1之间的差异，Holst-Jensen 等1998年利用ITS研究了核盘菌及其近缘属间的系统发育6。

4、本研究通过克隆核糖体转录间隔区，结合形态学特征对病原菌进行鉴定；以碳、氮源，温度，酸碱度等生理指标研究病原菌生物学特性；运用平皿法和盆栽法筛选出几种有效的杀菌剂和生防菌，并对病害防治进行了初步探索。1材料与方法1.1病原鉴定形态学特征观察 病原菌菌核于2001年9月采自江苏省句容市磨盘乡潘冲村苜蓿病区土壤。将菌核表面消毒后置于PDA平皿中25ºC培养72h，取边缘菌丝于新鲜PDA平皿中培养72h，在显微镜下切取菌丝尖端约1mm，进行纯培养，得菌株NJ1。将采集到的子囊盘和PDA平皿上生长的菌核用1NaClO表面消毒3min，切片于显微镜下观察。区的克隆与序列分析菌丝基因组DNA提取如

5、文献7所述。采用引物ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）和ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）8，以菌株NJ1菌丝基因组DNA为模板扩增ITS片段。PCR程序如下：95ºC变性5min；95ºC 40sec，52ºC 40sec，72ºC 1min，共30个循环；72ºC延伸10min。PCR产物连接pMD18-T（TAKARA公司），转化Escherichia coli DH5。重组质粒命名为pMD18-ITS，并测序（上海申友生物技术有限责任公司）。应用BLAST对序列同源性比较（）。1.

6、2温度对菌丝生长的影响在培养23d的菌落边缘打孔，转接至PDA平皿中央，每皿1片菌饼。分别在2、6、10、15、18、20、23、25、28、33和37下培养。每处理4个重复，每天定时测量菌丝生长直径，依文献9所述方法计算菌丝平均生长速率。1.3酸碱度对菌丝生长的影响用1mol/L的HCl和NaOH调PDA培养基pH值，梯度设为313。在培养23d的苜蓿菌核病菌落边缘打孔，各处理平板中央接种直径为7mm菌饼，4个重复，23恒温培养，每天定时测量菌落直径，并计算平均生长速率。1.4碳源和氮源对菌丝生长的影响以查彼(Czapek)培养基10作为基本培养基。分别用等量的乳糖、淀粉、甘露醇、葡萄糖、麦

7、芽糖、柠檬酸、D-果糖、D-木糖置换其中的蔗糖；分别用等量的谷氨酸、硫酸铵、硝酸钾、L-天冬碱、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸置换硝酸钠，配成不同碳源和氮源的培养基,调pH至7.0。设无碳、无氮和水琼脂对照。平皿中央接菌饼，23下培养，4次重复，每日定时测量菌落直径。1.5杀菌剂对病原菌的杀菌毒力实验采用12种杀菌剂：赤霉清（25%多·酮WP，江苏省绿盾植保农药实验有限公司），灰核克星（50%多·霉威WP，山东寿光双星化工厂），速克灵（50%二甲酰亚胺WP，日本住友化学工业株式会社），万霉净（55%甲硫·菌核净WP，山东神星农药），土菌灵（20%乙酸铜WP，山东绿丰农

8、药有限公司），百菌清（75%四氯间苯二晴WP，日本SDS Biotech K.K.），可杀得（77%氢氧化铜WP，美国固信公司），多菌灵（50% WP，石家庄市华星农药厂），敌克松（55%敌磺钠WP，辽宁省丹东市农药总厂），福美双（50%双硫胺甲酰WP，天津市捷康化学品有限公司），根必治（45%五氯·福WP，山东绿丰农药有限公司），百菌通（60%琥·乙膦铝WP，齐齐哈尔四友化工实业有限公司）。每个药剂设500、1500、2000倍3个浓度，将称量好的药剂与熔化的PDA混合，倒平板。以不添加药剂的PDA为空白对照，每处理4个重复。平皿中央接菌饼，23培养，每日定时测量菌落直径

9、，依文献11所述计算相对抑制百分率。对抑菌显著的药剂降低浓度作进一步筛选。1.6杀菌剂的温室生测苜蓿种子催芽后播种，每处理设3次重复，每重复5个苗钵（10×9.7×6.4cm），每钵播20粒种子，待五叶期时接种麦麸培养的病原菌培养物约2g（菌:麦麸1:1），菌上覆土1cm。接种两天后喷洒化学药剂，各药剂分别设500、1000、2000倍浓度。以不接病原菌(CK+)和不喷洒药剂(CK)为对照，实验室温为2530。依据文献12所述分级标准计算病情指数和防效。1.7拮抗细菌的筛选系列稀释法从句荣苜蓿菌核病、油菜菌核病土中分离细菌。取1g土样溶于10ml灭菌水，系列稀释至105倍，

10、各取100µL均匀涂布于LB平板上，28培养48h，挑取形态有明显差异的菌落保存备用。平皿对峙法筛选拮抗NJ1的细菌，记录抑菌带大小，每个处理设3次重复。1.8生防菌生物测定将分离到的细菌S1、S2、S3与来自中国农业大学生防室的生防细菌Bacillus megaterium B130、B. subtilis B908接种于LB培养液中28培养。将已催芽的种子分别浸于浓度为108CFU/ml的各生防菌液中20min，无菌水作对照。播种后到五叶期时接种病原菌，方法同1.6。2结果与分析2.1菌株NJ1的鉴定结果菌株NJ1的菌核黑色，球形或椭圆形，表面粗糙，直径45mm，在PDA中于平皿

11、边缘生长。子囊盘褐色，盘形，直径25mm。子囊棍棒形，子囊孢子椭圆形，单胞，无色，形态特征与核盘菌属最为相近。123MM10.5kb kb3 kb1 kb利用引物ITS4与ITS5可以扩增到长度为1,040bp的片段（图1，泳道2），其中第495643bp为ITS1区，第644801bp为5.8S 亚基，第802948bp为ITS2区。图2为目标菌ITS区（包括5.8S亚基）核苷酸序列同源性比对结果。菌株NJ1 ITS区与 Sclerotinia trifoliorum同源性达100%，与S. sclerotiorum同源性为99%。菌株NJ1与S. sclerotiorum相比，在ITS1区

12、有一个、ITS2区有两个碱基发生变化，5.8S rDNA的核苷酸序列完全相同，可见核糖体小亚基在属内种间是高度保守的，ITS区在种间具有变异性。结合形态学特征分析可以确定菌株NJ1为三叶草核盘菌（S. trifoliorum）。图1 菌株NJ1基因组DNA及ITS片段电泳图谱Fig.1. The electrophoresis of genome DNA and ITS of strain NJ1M: 1 kb标准DNA；1: NJ1基因组DNA；2: ITS片段PCR产物；3: Pst、BamH双切pMD18-ITSM: 1 kb size DNA marker; 1: NJ1 genomi

13、c DNA; 2: ITS segment by PCR; 3: pMD18-ITS digested by Pstand BamH1 CAGAGTTCAT GCCCGAAAGG GTAGACCTCC CACCCTTGTG TATTATTACT TTGTTGCTTTêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêê

14、34;êê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêêêêêêêêêêêê êêêêêêê

15、;êêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê61 GGCGAGCTGC TCTTCGGGGC CTTGTATGCG C

16、GCCAGAGAA TATCAAAACT CTTTTTATTAêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêê&

17、#234;êêêêê êêêêêêêêêêêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêT êêêê&#

18、234;êêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê121 ATGTCGTCTG AGTACTATAT AATAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCTGGCêêêêêêêêêê êê&#

19、234;êêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêêê

20、4;êêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê ê

21、;êêêêêêêêê181 ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA GTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCAêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêê

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23、234;ê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê241 TCGAATCTTT GAACGCACAT TGCGCCCCTT GGTATTCCG

24、G GGGGCATGCC TGTTCGAGCGêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêê

25、34;êêêê êêêêêêêêêêêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêê

26、;êêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê301 TCATTTCAAC CCTCAAGCTC AGCTTGGTAT TGAGTCCATG TCAGCAATGG CAGGCTCTAAêêêêêêêêêê êêê

27、;êêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêêêê&

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29、#234;êêêêêêê361 AATCAGTGGC GGCGCCGCTG GGTCCTGAAC GTAGTAATAT CTCTCGTTAC AGGTTCTCGGêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê &

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31、234;êêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê421 TGTGCTTCTG CCAAAACCCA AATTTTCTAT GGTT strain NJ1ê&

32、#234;êêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêê Sclerotinia trifoliorum（Z99676） êêêêêêêêêê ê

33、êêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêê Sclerotinia sclerotiorum（M96382）图2 菌株 NJ1与近源菌ITS15.8S rDNAITS2区序列比对Fig. 2 Alignment of the ITS15.8S rDNAITS2 homologues2.2温度对菌丝生长的影响菌丝在不同培养温度下生长量不同（图3）。在33、37下

34、不能生长，实验设定的最低温度2仍可生长；1823为菌丝生长的最适温度；2、6和28下只缓慢的生长,菌丝不形成菌核（表1）；1015低温条件下菌核形成缓慢，10下培养30d才见到成熟菌核，在2023只需5d就形成黑色菌核；从菌核数量看，2025间产量最多。表1 菌核形成与温度的关系Table 1 The relationship between the sclerotium formation and temperature温度()Temperature26101518202325283337菌核形成期(天)sclerotium formation period 30179658菌核总数(个/皿

35、)sclerotium number4718419033注：为不产生菌核。表中数据为10次重复平均值。Note: none sclerotium. The data in the table are averages of 10 replicates.2.3 pH值对菌丝生长的影响苜蓿菌核病菌菌丝生长对pH值的适应范围较广，实验中pH值312范围内菌丝均可生长，但生长速度有明显差异。当pH值为5时菌丝生长最快，日生长量达到3cm。当pH值大于7时，菌丝生长速率随pH值增大而减小，pH值为13时菌丝不再生长（图4）。说明苜蓿菌核病菌适宜在中性偏酸环境下生长。 图3 菌丝在不同温度下的生长速率 图

36、4 不同pH值对菌丝生长的影响 Fig.3 The speed of growth in different temperature Fig.4 Mycelial growth in different pH value2.4 碳源和氮源对菌丝生长的影响氮源对苜蓿菌核病菌落生长影响较大(图5)，该菌硫酸铵利用最好，菌丝稠密；对L-天冬碱利用较好，生长速率快；可以利用谷氨酸、硝酸钾、DL-苯丙氨酸，但菌丝生长稀疏，菌落薄。其中在L-半胱氨酸的培养基上菌落生长最慢，且形态不规则。对于供试的9种碳源，该菌在甘露醇和乳糖中生长速率最快(图6)，但菌落稀疏；对蔗糖，可溶性淀粉和葡萄糖等碳源利用较好，菌落

37、形态正常，生长速率快，其中在淀粉培养基上菌丝生长致密；对D-果糖、D-木糖和麦芽糖利用能力较差，不能利用柠檬酸。2.5 杀菌剂对病原菌的杀菌毒力试验中对土菌灵等12种药剂进行杀菌毒力测定，其中百菌清、赤霉清、福美双、根必治、万霉净和速克灵6种药剂抑菌效果较好，500、1000、1500倍药剂浓度抑菌率达到或接近100，其它药剂则分别为093%不等。对上述试验6个药剂稀释浓度进行二次筛选。结果表明，根必治、速克灵和万霉净3000倍药图 5 不同氮源中菌丝生长速率 图 6 不同碳源中菌丝生长速率Fig.5 The speed of growth Fig.6 The speed of growth

38、in different nitrogen source in different carbon source液仍对病原菌表现了较好的抑制效果，抑菌率为100%（见图7）。百菌清、赤霉清、福美双3000倍液抑菌率分别为88%、83%、99。图7 化学药剂对病原菌生长的抑制作用Fig. 7 Inhibition effect of fungicide against NJ11百菌清（chlorothalonil） 2赤霉清（carbendazim-triadimefon） 3福美双（thiram）4根必治（kobutol-thiram） 5速克灵（sumilex） 6万霉净（diethofenc

39、arb）2.6 杀菌剂药效试验喷药7d后调查病指。如表2所示，三种药剂500倍液对苜蓿菌核病防效均达到或超过45，速克灵1000倍液接近50，而根必治2000倍液的防效达到52.4。相对无施药对照，三种药剂的病情指数均显著降低，且各处理间病情指数差异显著；从防效上看，根必治各处理均好于速克灵与万霉净。由于根必治2000倍液处理病指与1000倍液处理病指无显著差异，因此，根据低浓度，低污染的施药原则，根必治2000倍液应当是理想的防治苜蓿菌核病的药剂倍数，但田间效果有待进一步试验证明。表2 几种化学药剂对苜蓿菌核病的盆栽试验防效Table 2 Control effect of fungicid

40、e on NJ1处 理 Treatment病情指数 Disease index500 1000 2000防效(%) Control efficiency500 1000 2000对照 Control77.6a55%万霉净WPdiethofencarb42.3b49.8b54.3b45.435.830.050%速克灵WPSumilex29.8c38.8c45.2c61.649.941.745%根必治WPkobutol-thiram20.3d28.4d36.9d73.963.652.4注：同列数据后标有相同字母者表示在5%水平差异不显著，下同。Note: The same letters in t

41、he same column means they were not significantly different at 5% level by Duncans multiple range test, the same to below.2.7 生防菌对病菌的拮抗能力室内应用平板对峙法筛选出三种对病原菌拮抗效果显著的细菌，代号分别为S1、S2、S3。其中S1抑菌带达1.8cm，S2为1.5cm，S3为0.4cm。对来自中国农大植病生防室的生防菌进行筛选，B130抑菌带宽1.7cm，木霉-T10、木霉-XW2，细菌B908也具有拮抗效果。2.8 生防菌生物测定 在实验条件下对照发病快而且严重

42、，接种病原菌20d后几乎全部发病。从表3可以看出，各生防菌处理病指均显著低于对照病指，其中S2防效最好，最高时达67.5%，而且在对照发病达90%时防效仍维持在60%，说明S2防效持续时间长且效果稳定。S1防效最低，而且持续时间最短，7d后防效开始降低。其余菌株的防效均维持在50%左右，防效较持久。表3 不同生防菌防治效果Table 3 Effect of biocontrol bacteria on suppression of NJ1处理Treatment病情指数 Disease index7d 10d 15d防效(%) Control efficiency 7d 10d 15d对照 Co

43、ntrol41.7a67.3a86.6aS121.4bc32.8c51.4c48.751.340.6S217.7c21.9d33.2d57.667.561.7S327.9b53.4b74.7b32.020.714.1B13019.9bc31.3c48.5c52.453.544.0B90818.5c30.9c46.1c55.754.146.83结论与讨论本研究运用ITS法对我国江苏丘陵地区苜蓿菌核病进行病原鉴定。结果显示菌株NJ1的ITS15.8S rDNAITS2核苷酸序列与Sclerotinia trifoliorum的完全相同；与S. sclerotiorum同源性为99%，三个变异位点分

44、别发生在ITS和1TS2区，5.8S rDNA序列相同。说明5.8S rDNA在核盘菌种间是保守的，而ITS区在种间具有变异性，因此ITS区序列的差异可为核盘菌种水平的鉴定提供一定依据。本研究结合形态学特征可以确定，发生在我国苏南丘陵地区的苜蓿菌核病是由三叶草核盘菌（S. trifoliorum）引致。江苏省句容地区的苜蓿菌核病菌菌株，在实验室条件下菌丝生长的温度范围为228，1823为最适生长温度。低于6、高于28均不产生菌核。2025形成菌核的速度最快，数量最多。在当地，4、5月份日均温达到20，适合菌核形成，菌核病大量发生，可根据发病期提前进行防治。该菌对酸碱度适应范围广，pH值312范

45、围均能生长，pH值为5时菌丝生长最快，pH值大于7时，菌丝生长速率随pH值增大而减小，pH值为13时菌丝不再生长。由此可见苜蓿菌核病菌菌丝适宜在中性偏酸环境下生长。当地土壤属黄棕壤，肥力低，pH值6.5左右，酸碱度适宜苜蓿菌核病的发生，因此，播种时增施石灰和磷、钾肥可能提高植株抗病性。根必治、速克灵和万霉净均为亚胺类杀菌剂，当质量浓度稀释到0.33%时，对病原菌的抑制率仍达到100。盆栽试验中速克灵500倍液和根必治5002000倍液防治效果较好，可以此为基础开展田间实验，以确定最佳浓度和最佳喷施时间，从而为苜蓿菌核病的防治提供依据。已有实验表明，播前用木霉菌菌粉拌种或直接施用到土壤，对温室黄

46、瓜根腐病和田间油菜菌核病防效分别达到50%和60%，并有长期效果13。本试验通过平板对峙法筛选到几株有效抑制菌株NJ1的生防菌，温室生测表明S2生防效果较好，但其生防机理仍须进一步研究。生物防治以其独特的优势越来越受到植保工作者的重视，本实验中生防菌的抑菌效果虽不及杀菌剂，但其较稳定的防效以及无污染的特点仍值得深入研究。参 考 文 献1 苏祖芳基蘖肥与穗粒肥配比对水稻产量形成的影响水稻群体质量理论与实践北京: 中国农业科技出版社, 1995: 155-1602 Sharma S K, Verma B R, Sharma B K. Biocontrol of Sclerotinia sclero

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