种子发育相关性状影响含油量的遗传学机制

1、国家重点基础研究发展计划973计划课题任务书项目名称：油菜籽油脂形成的分子生物学机制及其代谢调控课题名称：种子发育相关性状影响含油量的遗传学机制课题编号：2006CB101604中华人民共和国科学技术部制2006年09月01日一、研究内容油菜种子既是维持世代延续的繁殖器官，也是油菜的产品油脂和蛋白质的储藏器官。油菜种子中油脂、蛋白质和粗纤维大约各占35-45，28-32和7-15，其比例有着明显的消长关系；油菜种子大小（粒重）是油菜产量的直接构成因素；油菜种子发育和最终形成受到一系列复杂的遗传和环境因素的影响，种子成熟过程中，特别是后期的温度逆境对种子产量和质量会产生严重的负面效应。本课题将从

2、上述三个方面对影响油菜种子含油量和产量的种子发育相关性状开展研究，试图深入了解控制这些性状的遗传及分子机理，为有效调控油菜种子发育以提高种子含油量和产量提供理论依据。本研究的特色主要体现在：1. 选用多种来源的材料，将遗传基础复杂的性状， 如甘蓝型黄籽形成的遗传和生化控制，分解成单个组成因素进行深入剖析；2.既研究性状的单基因和多基因控制，也研究基因网络上重要基因的互作。本研究的创新点主要有：1. 将为解决一些长期困扰育种家的难题提供答案，如甘蓝型油菜中黄籽性状、种子大小的基因控制，油菜中有关种皮色素合成的分子机制等；2.将克隆一批对种子含油量和产量相关性状有重要影响的基因，并分析这些基因间的

3、相互作用；3.将对种子发育过程中基因表达特征、不同基因对环境因素的应达反应，以及这些反应对调控种子发育性状的意义有新的认识，进而提出通过调控种子发育相关性状提高含油量和籽粒产量的分子操作途径。1种皮厚薄及黄籽性状的分子遗传学机制精细定位与粒色和种皮性状有关的主效基因和QTL；克隆种皮发育，木质素和种皮纤维素生物合成的关键调控基因和结构基因，明确其影响种皮纤维素积累的分子机理；分析黄色种皮形成的遗传机理，克隆与种皮色素生物合成与沉积有关的重要调控基因，研究它们与重要结构基因启动子的关键顺式元件的作用机理。2控制油菜种子大小的基因网络及重要基因的功能分析利用油菜籽大小突变体和近等基因系研究籽粒大小

4、对油分积累和籽粒产量的影响；定位与种子大小相关的主效基因和QTL；利用定位结果和拟南芥的分子生物信息学,分离克隆与油菜籽粒大小有关的重要基因3-5个,利用酵母双杂交系统建立与种籽大小有关的蛋白质及相应基因的互作网络;通过基因失活或超量表达等技术，分析基因网络上关键基因的功能。3影响油菜结实重要基因的鉴定和功能分析利用作图群体分析不同生态条件下油菜结实性状表现,定位影响种子后期成熟的相关基因；利用拟南芥和油菜花器官形成及种子发育突变体分离相关基因，用拟南芥cDNA 和油菜种子特异EST芯片, 建立不同发育阶段油菜种子的基因表达谱，分析在长江中下游地区热害条件下油菜种子中相关基因的差异表达,克隆3

5、-5个结实相关基因并分析其功能。1. 二、预期目标深入了解控制种皮厚薄，籽粒颜色以及油菜种子大小控制的分子遗传学机理。2. 克隆10个以上与种皮厚薄，种皮颜色，种子大小，种子结实效率等种子发育有关的基因，并对其中3-5个基因的功能进行详细分析。3. 发表SCI论文57篇，申请专利1-2项。提出通过调控种子发育相关性状提高含油量及籽粒产量的分子操作途径。三、研究方案及技术路线1、种皮厚薄及黄籽性状的分子遗传学机制1） 以华中农大构建的DH系作图群体（HZ）和西南大学构建的重组自交系群体（SW）为材料， 采集多年多点性状数据，利用SSR、AFLP、SRAP等标记精细定位与粒色和种皮性状有关的主效基

6、因和QTL，建立600个以上标记的遗传连锁图谱，提出2篇有关油菜粒色和种皮性状主效基因和QTL分析的SCI论文（2007、2009）。2） 以油菜黄、黑籽近等基因系为材料，利用拟南芥的分子生物学信息，克隆种皮发育，木质素和种皮纤维素生物合成的关键调控基因和结构基因，明确其影响种皮纤维素积累的分子机理。提出2篇有关种皮发育，木质素和种皮纤维素生物合成的关键调控基因和结构基因的SCI论文（2007、2008），申请专利1项。3） 针对甘蓝型油菜中与种皮发育和色素合成相关基因的序列特征，利用RNAi技术研究植物种皮色素合成基因的表达，分析黄色种皮形成的遗传机理，克隆种子发育过程尤其是种皮发育过程中调

7、控种皮色素生物合成与沉积的重要调控基因，研究它们与重要结构基因启动子的关键顺式元件的作用机理，提出12篇有关基因功能与作用机理的SCI论文（2008、2009），申请专利1项。2控制油菜种子大小的基因网络及重要基因的功能分析4） 利用油菜种子大小突变体分析油菜种子大小（粒重）的遗传控制，分析粒重与含油量、籽粒产量的关系及其与环境的互作。5） 用华中农业大学TN（DH系群体）和LW（F2群体）群体定位与种子大小相关的主效基因和QTL，分析千粒重与含油量和蛋白含量的关系。构建千粒重主效QTL的近等基因系，创建单个粒重基因的精细定位群体及目标基因区段的物理图谱，利用BAC文库、cDNA文库分离和克隆

8、LW群体的大粒等位基因。提出1篇油菜种子大小QTL分析的SCI论文（2008）6） 利用拟南芥种子大小研究的分子生物信息学，用候选基因法克隆油菜的同源片段，将这些候选基因整合到已有的遗传连锁图，确定它们与已定位的种子大小相关的分子标记的关系；通过基因失活或超量表达分析，明确克隆的油菜候选基因对种子大小形成的影响，结合上述种子大小相关的主效基因和QTL定位结果，选择3-4个效应明显的基因作为酵母双杂交（Y2H）分析的诱饵基因；构建供Y2H筛选的cDNA文库，通过酵母双杂交分析鉴定与诱饵基因蛋白互作的其他蛋白，建立与种籽大小有关的蛋白质及相应基因的互作网络。7） 根据种子大小基因网络分析结果和LW

9、大粒等位基因的鉴定，重点对2-3个在油菜种子大小起重要作用的基因进行功能分析。提出2篇控制油菜种子大小基因调控的SCI论文（2009）。3、影响油菜结实重要基因的鉴定和功能分析1) 利用多年多点种植的作图群体分析不同生态条件下油菜结实性状表现，定位影响种子后期成熟的有关的主效基因和QTL；提出1篇油菜结实性状控制的SCI论文（2008）。2) 用拟南芥cDNA 和油菜种子特异EST芯片, 建立不同发育阶段油菜种子的基因表达谱，综合运用拟南芥有关种子发育研究的生物信息学结果，鉴定与油菜种子发育相关的基因，用RNAi和过量表达分析，对其中3-5个重要基因的功能进行深入分析。提出1篇与油菜种子发育基

10、因调控有关的SCI论文。3) 在控制条件下，模拟长江流域油菜种子发育后期热害环境，分析正常温度和热害条件下油菜种子发育和油分积累相关基因的差异表达,克隆3-5个结实相关基因并分析其功能。提出12篇与结实相关基因功能与作用机理的SCI论文（2010）四、年度计划年度研究内容预期目标第一年1 利用西南大学的黄籽×黑籽两个组合的重组自交系群体（SW1,SW2）两年3点的数据， 对粒色、种皮色素、皮壳率、木质素、含油量、籽粒大小等性状有关的主效基因和QTL定位研究；2 利用华中农大的DH系群体（HZ1）和F2群体（HZ2）进行粒色定位，构建两个粒色主效QTL的近等基因系；3 克隆种皮发育，木

11、质素和种皮纤维素生物合成的关键调控基因和结构基因；4 田间种植种子大小定位F2群体（LW）和DH群体（TN），利用SSR、AFLP等分子标记构建分子标记连锁图，对千粒重及其他相关性状进行QTL定位；5 利用拟南芥生物信息学，克隆与种籽大小控制的相关基因；6 多点种植供种子结实性状分析的群体。1.利用SW1、SW2建立含600个以上标记的遗传连锁图谱；利用HZ1构建 含400个以上的遗传连锁图谱；2.定位与粒色形成有关的QTL；3克隆与粒色、种皮色素、皮壳率、木质素、含油量、籽粒大小等种子发育相关的候选基因10个以上；4.在LW群体构建至少包含250个DNA分子标记的遗传连锁图；5定位控制千粒重

12、、含油量和蛋白质含量的QTL，分析这些QTL之间的相互关系。第二年1 继续对粒色、种皮色素、皮壳率、木质素、含油量、籽粒大小等性状有关的主效基因和QTL的精细定位分析；2 继续粒色主效QTL近等基因系的构建工作； 3 通过正义和反义载体构建和遗传转化，分析已克隆种皮发育，木质素和种皮纤维素生物合成基因的功能和影响种皮纤维素积累的分子机理；4 利用全基因组分子标记信息，从LW F2群体中选择遗传组成最相似、但在目标基因区段分别带有大粒和小粒等位基因的单株构建粒重近等基因系；5 将已克隆的与控制种子大小有关的基因定位在分子标记连锁图上，分析与所定位QTL之间的关系；6 用已克隆的与粒重相关的油菜基

13、因构建抑制和超量表达载体，用以转化拟南芥和油菜以分析其功能；7 构建酵母双杂交（Y2H）文库；8 继续种子结实性状分析作图群体的多年多点种植及分析；9 高含油量材料在控制条件下进行高温处理，获得温度对含油量和结实率影响的初步数据。1获得对粒色、种皮色素等有关性状遗传控制的初步了解；2提出种皮发育，木质素和种皮纤维素生物合成相关基因功能分析的SCI论文1篇；3. 申请专利1项；4. 获得23个主效粒重的近等基因系单株；5. 获得与千粒重QTL相吻合的拟南芥候选基因及油菜中的同源基因；6. 获得一批转种子发育相关基因的转基因油菜单株；7. 结实有关性状的QTL初步定位。第三年1、 通过3年的分析，

14、明确已克隆的种皮发育、木质素和种皮纤维素生物合成基因的功能和影响种皮纤维素积累的分子机理；2、 利用RNAi技术研究植物种皮色素合成基因的表达，分析黄色种皮形成的遗传机理；3、 利用来自HZ2的粒色近等基因系进行黄籽的精细定位；4、 利用来自LW的主效粒重基因近等基因系配制杂交组合，以构建粒重近等基因系作图大群体；5、 分别对大粒和小粒亲本的拟南芥候选基因进行比较测序，寻找突变位点；对不同来源的大粒和小粒品种进行比较测序；6、 克隆粒重候选片段的全长基因，分析其在各组织器官中的表达，构建转化载体，并开始遗传转化；7、 通过对与粒重相关的油菜候选基因的功能分析，确定3-4个用作Y2H互作筛选的诱

15、饵基因；8、 利用拟南芥cDNA 和油菜种子特异EST芯片，对油菜种子主要发育阶段进行基因表达谱分析；9、 利用多年多点种植的群体进行结实性状的QTL定位；10. 对不同温度处理下油菜材料进行基因差异表达分析。1提出对种皮纤维素积累、皮色素合成等有关基因功能分析的SCI论文1篇；2申请专利1项；3. 提出1篇油菜种子大小QTL分析的SCI论文；4. 获得粒重候选基因全序列，得到不同来源的大粒和小粒品种之间差异，确定导致粒重改变的突变；5. 获得油菜种子主要发育阶段基因表达谱数据；6.鉴定出与结实有关性状的QTL。第四年1. 用与来之HZ2粒色基因紧密连锁的特异片段筛选BAC文库，对侯选的阳性克

16、隆进行PCR分析、测序，构建粒色基因区段的物理图谱；2. 利用LW粒重近等基因系作图大群体，用BSA法筛选与粒重基因紧密连锁的分子标记；构建目标基因区段的物理图谱，开展目标基因区段的基因组测序；3.构建大粒等位基因载体，并转化验证功能；4. Y2H筛选，建立于种子大小有关的基因互作网路；5.定位影响油菜结实率的主效基因和QTL；6.通过基因表达差异分析，克隆影响油菜种子后期发育及结实率的相关基因；利用RNAi和超表达分析，阐明其功能。7. 用转基因方法，将鉴定出与粒重、种子发育有关的重要基因聚合到同一品系，研究这些基因的协同作用对种子发育、含油量及种子产量的影响。1.完成粒色基因的精细定位，将

17、目的基因缩小至约100kb的DNA片段上；2. 提出有关粒色基因精细定位的SCI论文1篇3.完成粒重基因的精细定位，将目的基因缩小至100kb的DNA片段上。4. 完成粒重基因100kb的基因组测序，确定候选基因。5. 完成种子发育基因表达谱的数据分析，提出有关SCI论文1篇6. 克隆影响油菜种子后期发育及结实率的相关基因3-5个，提出有关结实率和籽粒大小基因功能及调控机理的SCI论文1篇。第五年1. 对HZ2群体粒色候选片段进行克隆和功能分析；2. 完成LW群体粒重等位基因克隆和功能分析，包括对不同的大粒和小粒品种进行比较测序，对大粒和小粒亲本发育种子进行切片观察，确定大粒和小粒亲本细胞数目

18、和细胞大小的区别，对上述切片进行RNA原位杂交，确定粒重基因在发育种子中的表达部位；3.对Y2H鉴定出的控制粒重有关的关键基因进行功能分析；4.对通过热处理基因差异表达分析鉴定出的结实相关基因作进一步的功能分析；5. 继续对控制粒重、种子发育等重要基因的聚合品系进行分析。1.明确油菜黄籽形成的分子机理；2.确定不同的大粒和小粒品种之间控制粒重的机制是否相同，阐明大粒形成的分子机理；3.建立控制种子大小及种子发育的基因网络，阐明其中3-5个重要基因的功能；4. 提出SCI论文1-2篇；5. 提出通过调控种子发育相关性状提高含油量及籽粒产量的分子操作途径。 五、科学数据汇交计划课题组内各参加单位每月的30日将有关数据通过网络送交华中农大。这些数据包括：含油量及与含油量相关农艺性状值数据、分子标记、遗传图谱和QTL数据、cDNA和基因组序列相关数据、近等基因系数据等，Brassica中各个物种比较基因组和蛋白质组数据。华中农大在每月的15日前将数据整理后提交到项目组建立的油菜基因组油脂数据库网站（Genome of Brassica oil crop on fat acid: ）。该网站是项目组开展协作、数据搜集、数据分类、生物信息学分析