葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子

1、葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子            葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子    2008-5-9 12:01:59                        

2、60;                                          作者：吴海琴，张 蓓，张桂莲，展淑琴，张茹，赵英贤     【关键词】

3、  血管性痴呆    摘要：目的  观察葛根素对血管性痴呆(VD)大鼠海马中低氧诱导因子1和红细胞生成素表达的影响并探讨其可能机制。方法  采用大鼠双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)建立VD的动物模型，SD大鼠随机分为假手术组、2VO组和葛根素组，每组又分为1周、3周、6周、2月(n=6)四个时间点；应用Y型水迷宫实验测定动物的学习记忆能力，采用免疫组化法检测大鼠海马CA1区HIF1和EPO蛋白的表达。结果  2VO组和葛根素组大鼠游全程时间和误入盲端次数均显著增加，但各时间点葛根素组大鼠的学习记忆成绩均显著优于2

4、VO组。各时间点，2VO组和葛根素组大鼠海马CA1区HIF1和EPO的表达均较假手术组明显增高，但葛根素组两种蛋白的表达均较2VO组明显降低。结论  葛根素可提高缺血脑组织细胞内氧浓度，改善学习记忆功能，对VD具有确切的保护作用。    关键词：葛根素；血管性痴呆；低氧诱导因子1；促红细胞生成素    ABSTRACT: Objective  To observe the effects of puerarin on the expression of hypoxia inducible fac

5、tor1and erythropoietin in the hippocampus of vascular dementia rats and to investigate its possible mechanisms. Methods  Rats of experimental group were treated with a permanent bilateral common carotid arteries (CCA) occlusion (2VO) to establish vascular dementia model. Male SD rats were rando

6、mly divided into three groups: shamoperated group, 2VO group and puerarin group(twentyfour rats in each group). Rats were evaluated on learningmemory ability by Ytype water maze test. At corresponding time points at 1w, 3w, 6w and 2mon, the dynamic expression of HIF1 and EPO in CA1 region of hippoca

7、mpus was determined by immunohistochemical method. Results  The swimming time and error times of rats in 2VO group and puerarin group were significantly increased; but at all time points the rats in puerarin group showed better performance than those in 2VO group. Both in 2VO group and puerarin

8、 group, the number of HIF1 and EPO positive cells in hippocampal CA1 region were much more than that in shamoperated group; but the expression of HIF1 and EPO at each point in puerarin group was distinctly less than that in 2VO group. Conclusion  Puerarin can increase the intracellular oxygen c

9、oncentration and improve learningmemory ability during cerebral ischemia, and it has definitely protective effects on VD.    KEY WORDS: puerarin; vascular dementia; hypoxiainducible factor1; erythropoietin    葛根素是从中药葛根中提取的主要有效成分之一，是一种异黄酮类化合物，具有明确的扩张血管、改善微循环的作用

10、，已被广泛应用于心脑血管疾病的治疗。低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1, HIF1)是低氧应答时诱导基因表达和恢复细胞内环境稳定的一个核心调节因子。红细胞生成素(erythropoietin, EPO)编码基因是HIF1下游40余种靶基因之一。葛根素对HIF1和EPO在血管性痴呆(vascular dementia, VD)发生发展过程中表达的影响及其是否通过HIF1/EPO信号转导途径发挥对VD的保护作用尚未见报道。    1  材料与方法    1.1  动物

11、分组  健康、雄性SD(SpragueDawley)大鼠72只，体重(280±20)g，鼠龄2-3月(由        葛根素对血管性痴呆大鼠海马中低氧诱导因子    2008-5-9 12:01:59                     

12、60;                           明显下降(P<0.05)，但葛根素组各时间点学习记忆成绩均较2VO组有明显提高(P<0.05，表1、表2)。表1  不同实验组大鼠的学习成绩（略）表2  不同实验组大鼠的记忆成绩（略）    2.3 

13、; HIF1和EPO的表达  2VO组和葛根素组各时间点、各大鼠海马和大脑皮层均可见不同数量的HIF1表达，以缺血1周时最明显，此后缓慢下降，但仍处于较高水平，主要是海马和皮层的锥体细胞，血管内皮亦有明显HIF1阳性细胞分布，胞浆、胞核均有明显着色(图1、图2)。EPO亦于相应时间点明显表达于2VO组和葛根素组大鼠的海马各区和大脑皮层，其蛋白表达随时间变化的规律与HIF1大致相同(图3)，而且在2VO组和葛根素组，HIF1和EPO两蛋白的表达在P0.01水平上呈显著正相关(r2VO=0.953，rPu=0.931)。除神经元外，EPO还大量表达于星形胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞，

14、主要是胞浆表达(图4)。假手术组HIF1和EPO阳性细胞偶见(图5、图6)；葛根素组各时间点两蛋白的表达与2VO组相比明显减少(表3、表4)。图1  2VO组1周时海马CA1区HIF1的表达（略）图2  2VO组HIF1在血管内皮细胞的表达（略）图3  2VO组1周时海马CA1区EPO的表达（略）图4  2VO组EPO在室管膜细胞的表达（略）图5  假手术组1周时海马CA1区HIF1的表达（略）图6  假手术组1周时海马CA1区EPO的表达（略）表3  不同实验组大鼠海马CA1区HIF1的阳性细胞数（略）表4  不

15、同实验组大鼠海马CA1区EPO的阳性细胞数（略）    2.4  大鼠学习记忆能力与HIF1、EPO阳性细胞数的关系  2VO组和葛根素组大鼠两蛋白表达与学习记忆能力在P0.01水平上呈显著相关(表5)。假手术组两蛋白表达与大鼠学习记忆能力均无相关性。表5  HIF1和EPO的表达与大鼠学习记忆成绩的关系（略）    3  讨    论    HIF1作为具有转录调控作用的DNA结合性蛋白质因子，对缺氧具有

16、特异感受性。在缺氧条件下，HIF1广泛存在于哺乳动物和人体内，通过作用于靶基因的缺氧反应元件调控相关基因的表达，引起细胞一系列对缺氧的反应，以保持机体的氧稳态，具有重要的病理生理学意义。HIF1是由和亚基组成的异二聚体，其中亚基受低氧诱导表达，是调节HIF1活性的功能亚单位。EPO是一种水溶性、含唾液酸的酸性糖蛋白，除作为造血因子调节和维持血液中红细胞水平外，脑源性EPO还可以通过拮抗兴奋性氨基酸毒性、清除自由基、抗炎症、抗凋亡、提高神经突触传递以及类似神经营养因子样作用发挥神经营养、神经保护作用，有助于新生神经元的产生和缺损功能的修复。实验中发现2VO组大鼠海马CA1区HIF1和EPO阳性细

17、胞数显著高于假手术组，两种蛋白表达的时间规律和组织分布呈显著一致性，并且2VO组两种蛋白的表达在缺血各时间点与其相应的学习记忆能力在P=0.01水平上呈显著相关，从而表明HIF1和EPO参与了VD的发生发展过程，并可能通过HIF1/EPO缺氧信号转导途径发挥了保护作用。VD存在的组织、细胞缺氧使HIF1表达大量增加，激活了转录调节因子HIF1，调节转录其下游靶基因，主要包括：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth fractor, VEGF)及其受体VEGFR；葡萄糖载体蛋白(glucose trnsporter, GLUT)、腺苷酸激酶(adenylate

18、kinase, AK)和醛缩酶(aldolaseA, ALDA)、丙酮酸激酶M(pyruvate kinase M, PKM)、乳酸脱氢酶A(lactatedehedrogenaseA, LDHA)等糖酵解酶；血红素加氧酶(hemeoxygenase1, HO1)、诱导型NO合酶(iducible nitricoxide synthase, iNOS)、内皮素1(endothelin 1, ET1)；P21、P53、Bcl2、Bax9；胰岛素样生长因子1(insulinlike growing factor 1, IGF1)；肾上腺髓质素(Adrenomedullin,AM)；EPO等40余种

19、蛋白和酶的编码基因，从而参与调控血管生成、能量代谢、血管舒缩反应、细胞凋亡与增殖、红细胞生成、自由基清除、抗兴奋性氨基酸毒性等诸多病理过程，此过程也是VD发生的可能的神经生化、血管改变、能量转换机制。葛根素，化学名4,7二羟基8D葡萄糖基异黄酮，是中药葛根的主要有效成分。本研究从造模后动物的自发活动、反应速度等一般行为学情况以及大鼠的学习记忆成绩等方面直接证实了葛根素对VD具有确切的保护作用。实验中还发现葛根素组大鼠海马CA1区HIF1阳性细胞数显著低于2VO组，由于细胞内氧浓度对HIF1的表达进行着精细的调节，随着细胞内氧分压的下降，HIF1的表达呈指数增加，所以葛根素组各时间点HIF1表达

20、显著低于2VO组。这一结果间接证明了葛根素可以促进缺血脑组织的血流灌注、提高缺血区氧浓度。我们推测其机制可能与葛根素的以下作用有关：扩张脑血管，增加血流量，改善脑微循环；抑制血小板聚集；主要成分为异黄酮，具有雌激素替代效应，抗凋亡，保护神经元；钙拮抗；清除自由基；拮抗谷氨酸等兴奋性氨基酸对神经细胞的毒性作用；降低血糖；降低血浆血栓素A2/前列环素水平。虽然葛根素组大鼠海马CA1区HIF1和EPO阳性细胞数介于假手术组和2VO组之间，但也不能排除葛根素可能是通过上调保护性因子HIF1发挥对VD的保护作用，要进一步明确上述保护作用是否与HIFl/EPO低氧信号转导途径相关还需要进一步研究。

21、0;   本研究从动物行为学和免疫组化阳性物质表达方面证实了葛根素在VD发生发展过程中对缺血神经细胞的保护作用，为临床上葛根素治疗VD提供了有力的依据。葛根素的这一积极作用，也为应用祖国传统医药治疗缺血(缺氧性)脑血管病展示了美好的前景。    参考文献：    De la Torre JC, Fortin T, Park GA, et al. Chronic cerebrovascular insufficilency induces dementialike deficits in

22、 aged rats .  Brain Res,1992,582(2):186195.    包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱 M. 北京:人民卫生出版社,1991: 4050.    3Solaroglu I, Solaroglu A, Kaptanoglu E, et al. Erythropoietin prevents ischemiareperfusion from inducing oxidative damage in fetal rat brain . Childs Nervous Sy

23、stem, 2003,19(1):1922.    4Villa P, Bigini P, Mennini T, et al. Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis . J Exp Med, 2003,198(6):971975.    5Lee SM, Nguyen TH, Park MH, et

24、al. EPO receptormediated ERK kinase and NFkappaB activation in erythropoietinpromoted differentiation of astrocytes .  Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(4):10871095.    6Liu LX, Lu H, Luo Y, et al. Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia induci

25、ble factor 1.  Biochem Biophys Res Commun,2002,291(4):908914.    7Okino ST, Chichester CH, Whitlock JP. Hypoxiainducible mammalian gene expression analyzed in vivo at a TATAdriven promoter and at an initiatordriven promoter . J Biol Chem,1998,273(37):2383723843.    8Hu J, Discher DJ, Bishopric NH, et al. Hyproxia regulates expression of the endothelin1 gene through ap