方法学验证的相关内容学习

1、方法学验证的相关内容学习日期：2008-09-17来源：中国药品生物制品检定所作者：wangchen序体：大 中小本文由 wangchen 根据药物所张金兰教授的授业内容整理而成 内容提要：（方法学验证的应用、依据、类型、一般参数、要求） 验证应用： 方法验证是对测定方法的评价，是建立新方法的研究内容和依据。（新建方法、已建立方法的修订验证、已建方法的复现）验证依据： 方法应用领域对方法验证要求的 “指导原则 ”验证类型： 全部验证 Fall validation 、部分验证 Partial validation 、交叉验证 cross validationlFull validation ：

2、第一次新建方法； 一个已建方法， 但增加分析对象 （精密、 回收）。lPartial validation ：（已建方法的部分改变）1）分析方法改变（检测器改变）；2）生物样品（抗凝剂改变）；3）基质改变（血尿）；4）前处理方法改变；5）生物样品种属改变（ rat 大鼠 mouse 小鼠）；6）仪器改变工作软件改变；7）稀有生物样品，取样量有限。lCross validation ：样品分析在不同场所或实验室进行时，不同实验室需进行加样生物样品或实际样品分析，建立实验室间的重现性数据。当分析数据由不同检测技 术产生时 LC MS vs ELSD 需交叉验证部分验证：准确度，精密度（都做） 交叉

3、验证：加样准确度，实际样品分析（任一）一般参数：精密度 precision:同一匀质样品的一组测量值，彼此符合的程度。1) SD 标准偏差 standard deviation2) % RSD 相对标准偏差 relative SD , CV 变异系数n>8标准差 SD=开方(求和(xi x均值)/ (n 1)% RSD = SD/x 均值 X100 %l日内精密度(intraday precision ):同一次测定，710份，按方法做。测定，SD值，RSD限度(生物制品 5 %，药品2 %)。l日间精密度(in terday precision ):不同一次测定，710份，按方法做。测

4、定,SD值，RSD限度(生物制品15 %，药品5 %)。准确性 accuracy :l结果与真值的接近程度，表示分析方法测定的正确性，通常用回收率实验表示(加样回收率)。l回收率=(测定液测定值原样液含测值)/加入量值X100 %灵敏度：l 检测限(limit of detection LOD ):分析方法能从背景信号中区分出药物，所需样 品中药物的最低浓度，LOD反映方法与仪器的灵敏度和噪音也表明样品经处理后本 底值的高低。S/N>3l 定量限(limit of quantitation LOQ )在保证具有一定可靠性(一定准确度和精密 度)分析方法能够测定出样品中药物的最低浓度。反映

5、分析方法测定含药物的低浓 度样品时的可靠性。选择性(selectivity )：分析方法从其他成分中区分并定量目标成分的能力l 专属性(specificity ):指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号l 选择性(selectivity ):指一种方法可对多种成分产生不同响应，主要成分响应可与其他成分区分选择性的区分选择内容:n化药：杂质、降解产物、相关化合物、制剂辅料（可通过空白比较和添加法所得分析结果比较确定）n体内药物：内源性物质、代谢物、分解产物、分析中的相伴物、内源性代谢物n体内药分的选择性内容：空白生物样品（血尿、胆汁等）、至少六个来源的生物样品（非 MS方法）、每个空白样品均测定

6、干扰和LOQ 。线性（liner ）：I给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力I线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且呈线性的供试物浓度的变化范围其最大、最小量间的间隔。I浓度范围包括5-8个浓度点，标准曲线应覆盖样品浓度范围。1. 药物一般80-120% （但低限不低于LOQ）2. 体内药物、浓度上线高于样品最高浓度，下限为 LOQ3. 相关系数（r）表示了线性度岸0.9900重现性（Repeatibility ）相同方法在正常条件下多次重复测定同一匀质样品所得分析结果的重现程度。稳定性（Stability ）l生物样品中药物的稳定性涉及储存条件

7、、药物理化性质、基质、容器系统。l Stability评价包括：样品收集与前处理、短期储存、长期储存、冻融、处理后稳定性。稳定性试验要求l Stability考察条件应反映实际测定过程的实验条件。l 应包括Stocking solution 稳定性的考察l冻融稳定性至少高、中、低三个浓度、三个冻融过程在真实实验条件下保存样品，室温化冻，至少保存 24小时，第二、三次相同条件下至少保存12-24小时，在第三个circle时分析。l如果样品不稳定，应在-70 C下保存l短期稳定性：样品化冻后室温 4-24 小时 考察稳定性l长期稳定性： 应包括第一样品 >最后样品分析结束的全过程 （三个浓度

8、、 足够样品）l处理后稳定性分析过程 一个方法经建立、验证、正常应用后进行分析。分析包括： 标准溶液配制、 分析法与过程建立、 验证后方法应用与建立分析结果认可的标准。 药物定量方法： LC 、 GC 、生化免疫、同位素标示。验证要求：1. 标准曲线至少 6 个点，包括 LLOQ （标准曲线最低浓度）、 ULOQ （最高 浓度） Upper limit of quantification2. 精密度 precision 和准确度 accuracy ：三个浓度，每个浓度进样 5 次，测 定与理论差 < 15%、LLOQ外w 20%。三个浓度的分布要求：lowQC sample=3*LLOQ middleQC= 中间点 highQC 接近曲线最高点3. 稳定性： 2 个浓度的三次冻融 （每个 2 次？） 生物样品的室温稳定性、 处 理后的稳定性。分析数据的可接受标准1. 标准曲线除 LLOQ ， CV 在 15% 以内2. QCsample 在分析过程中合理分布3. QCsample 至少 67%-><15%最多 33%->>15% 可接受4. 每样品周期中 QC 样品至少 5%中药指纹图谱方