第二章遗传图绘制

1、第二章遗传图绘制基因组测序为什么要绘图？基因组测序策略克隆重叠群法克隆重叠群法全基因组鸟枪法全基因组鸟枪法minimal tiling path 克隆重叠群法（clone contig approach) 先绘制高密度分子标记遗传图和大分子DNA克隆重叠群覆盖的基因组物理图，然后整合遗传图和物理图，绘制基因组整合图，挑选大分子DNA克隆逐个测序，最后进行序列组装。up to downup to down contig: contig:构成一段连续的构成一段连续的DNADNA序列的一组相互重叠的序列的一组相互重叠的DNADNA克隆克隆 全基因组鸟枪法(whole genome shotgun a

2、pproach) 在获得一定的遗传及物理图谱信息的基础上，绕过BAC克隆逐个排序的过程，全基因组被打断进行随机测序，根据序列之间的重叠组装成一系列连续的序列，再根据连续的序列上带有的标记将其锚定在染色体上。 down to updown to up绘制图谱的原因基因组很大，每次测序最长不超过1kb,因此基因组需要被打断成小片段测序，而克隆重叠群法测序需要根据图谱选择要测序的DNA片段，减少重复测序当利用全基因组鸟枪法测序时，小片段测序后需要组装成完整的基因组序列，尤其是当基因组存在大量重复顺序,会干扰排序，而利用图谱可以将测序的小片段准确定位于染色体上 2.1 遗传图与物理图 2.1.1 遗传

3、图 遗传图是应用遗传学分析方法（杂交实验或者家系分析）将基因或其他DNA分子标记标定在染色体上构建的连锁图。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义为1%交换率。 2.1.2 物理图物理图是应用分子生物学技术来直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp, kb or Mb)2.2 遗传作图标记 遗传标记（genetic marker) 遗传图有特征性的位置标记，用于表示基因组中特定顺序所在的位置。这些标记按孟德尔方式遗传，标记位点应是多态的遗传标

4、记的类型 基因标记 DNA标记 2.2.1 基因标记（性状标记）肉眼可分辨表型的遗传标记基因 比如第一张果蝇遗传图谱显示了负责身体颜色、眼睛颜色、翅膀形态等基因的位置缺点：可见表型性状数目十分有限，并且往往多个基因影响同一性状，因此分析很困难 2.2.1 基因标记（性状标记）生化性状基因 - -人类红细胞人类红细胞ABOABO血型位点标记，白细胞血型位点标记，白细胞HLAHLA位点标记位点标记 - -应用于细菌和酵母的遗传作图应用于细菌和酵母的遗传作图 2.2.1 基因标记（性状标记） 基因标记非常有用但并非理想，因为： 高等生物，可用作标记的基因十分有限 许多性状都涉及多基因 高等生物基因组

5、中存在大量的基因间隔区，用基因标记将在遗传图中留下大片的无标记区段 并非所有等位基因可以通过常规实验予以区分因此需要更有效的标记！ 2.2.2 DNA 标记 （DNA marker) 除基因外用于作图的DNA片段称为DNA标记 DNA标记也需要等位型成员 DNA标记的优点：数量多，容易识别，适合大规模开展工作 包括三种类型： 1) 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphisms，RFLPs） 2)简单序列长度多态性 (simple sequence length polymorphisms,SSLPs) 3)单核苷酸多态性(singl

6、e nucleotide polymorphisms,SNPs) 2.2.2 DNA 标记 （DNA marker)1)RFLPs 最早发现的分子标记，被称为第一代分子标记 使用限制性内切酶消化某个DNA分子后出现的长度多态性 DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化RFLPs的产生RFLPs的检测方法RFLPs的特点：i) 处于染色体上的位置相对固定; ii) 同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变; iii)同一凝胶电泳可显示不同多态性片段，表现为共显性； iv) 通常只有两种等位形式 2.2.2 DNA标记2）SS

7、LPs 是由于简单序列的重复次数不同，表现出DNA序列长度不同而产生的多态性 具多等位性（multiallelic) 第二代分子标记SSLPs可分为两种类型：小卫星DNA（minisatellite DNA)又称为可变数目的串联重复（variable number of tandem repeat,VNTRVNTR)。重复单位长度为15-65个左右的核苷酸,一般长度不超过20kb微卫星DNA（microsatellite DNA）又称简单序列重复（simple sequence repeat，SSRSSR），或称短串联重复（short tandem repeat，STR），重复单位长度为2-6

8、个,一般重复10-60次微卫星比小卫星更常用做DNA标记 小卫星在基因组中分布不均匀，更常见于染色体末端和着丝粒区。微卫星序列在整个基因组中分布均匀，而且密度高；小卫星不适用于PCR分型，因为它的重复单位较长，可以形成20kb长的聚集区，而微卫星区较短，通常小于150bp，用PCR扩增时反应快又精确。人类基因组约有6.5105个微卫星标记由于重复单位的不同，微卫星存在着多种不同的类型,并且出现的频率也有差异 -在人类基因组中，最丰富的微卫星是(AC)n、(AAAN)n、(AAN)n和(AG)n。(AG)n是作图中应用最广的重复序列 -(AT)n是植物基因组中最丰富的微卫星 STR/SSR的检测

9、SSLP的特点 i)染色体上的位置相对固定; ii) 操作简单，可以用PCR分型; iii) 同一凝胶电泳可显示不同多态性片段, 表现为共显性； iv）有多种等位形式由于SSLP标记多态性频率高，分布均匀，易于检测，是目前流行的分子标记 2.2.2 DNA标记 3) SNPs 第3代分子标记SNP就是基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性点突变分为转换和颠换，比例为2：1SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记SNP的特点 i)理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4，但多数为2； ii) 数量极大, 人类基因组大约有1000万个SNP； iii)

10、SNP与人类易感性疾病有关, 涉及药物基因组学； iv) 编码区SNP主要分布在密码子的第3个碱基位置SNP的检测可通过DNA 芯片技术或者直接测序几种分子标记特点的比较几种分子标记特点的比较标记类型标记类型 带型带型 等位型等位型 稳定性稳定性 技术难度技术难度 费用费用RFLPRFLP 共显性共显性 2 2 高高 难难 高高 SSLPSSLP 共显性共显性 多多 高高 易易 低低 SNP SNP 共显性共显性 2 2 高高 易易 高高 2.3 遗传作图的方法2.3.1 连锁分析 遗传作图主要依赖于连锁分析1905，Bateson，Saunder和Punnett；1911年Morgan揭示了

11、连锁分析的意义 同一染色体上的两个基因理论上应该共同传递给下一代。但事实上同一染色体上的完全连锁的想象只有极少数。大多数的基因是部分连锁的摩尔根用减数分裂时染色体的行为解释了同一染色体上的基因部分连锁的现象部分连锁的原因是基因之间发生了交换部分连锁的原因是基因之间发生了交换 摩尔根学生Sturtevant提出如果交换是随机发生的，一对并列的染色单体上任何两点发生交换的机会是均等的，那么基因间因交换而去连锁的概率与它们在染色体的距离成正比 因此重组率可以成为测量两个基因之间相对距离的尺度 计算出不同基因间的重组率，就可以构建出显示基因在染色体上相对位置的图。通过重组率作遗传图遗传作图的偏离染色体

12、上有重组热点（recombination hotspot)，染色体上这些位点之间比其它位点间有更高的交换频率，比如近端粒区和远着丝粒区有较高的的重组频率 性别之间也有重组频率的差异 两个基因间的多次交换会造成距离减少的假象虽然遗传作图有偏离的缺点，但通常能正确推断出基因的顺序，而且对基因间距离估计虽然遗传作图有偏离的缺点，但通常能正确推断出基因的顺序，而且对基因间距离估计的精确度足以构建出可为基因组测序计划提供框架的遗传图的精确度足以构建出可为基因组测序计划提供框架的遗传图2.3.2 不同模式生物的连锁分析有性杂交实验 可进行有计划的遗传实验的材料，如果蝇、老鼠、水稻、玉米等系谱分析 不能进行

13、有计划的遗传实验的材料，如人类、多年生树木DNA转移 不发生减数分裂的生物，如细菌和病毒有性杂交实验的连锁分析 遗传作图的关键在于确定减数分裂产生的配子基因型，但一般情况下检测配子基因型很困难 通常是进行遗传杂交实验，通过实验确定分别来自于两个亲本的配子融合产生二倍体子代的基因型，标准方法是测交分析（test cross) 两点杂交 多点杂交两点杂交三点杂交这个实验可确定标记C位于标记AB之间用性状为标记作图有很大的局限性，只能通过对下一代个体性状的分离才能推测出上一代配子的基因型组成DNA分子标记不以表型为参照，直接检测个体基因型组成，具有共显性特点，可提供当代个体基因型的分离比 以DNA分子标记构建遗传图的操作程序与经典的遗传作图类似，只是统计的性状是DNA标记SSR分子标记连锁图绘制SSR分子标记连锁图绘制系谱分析作图 系谱分析法即对某家庭性状相关成员进行 统计，分析性状之间的连锁关系，通过重组率进行相关基因定位。人类系谱分析细菌的遗传作图 接合