引物二聚体的形成

1、什么是引物二聚体怎样消除引物二聚体是引物的 3'端间相互错配扩增形成的。 引物二聚体的出现是必然的， 只是或多或 少的问题， 电泳时看不到引物二聚体带也不代表没有二聚体出现， 只是含量低我 们 的肉眼看不到而已。提高 PCR严谨性（包括提高退火温度，降低引物浓度等） 可大大降低二聚体的浓度。减少PCR产物中引物二聚体的方法：1从引物自身 着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法 ;2.可能模板有问题 ;模板浓度过小，适当加大模板量 ;酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可 降低它们的浓度；4.取你所要加的上下游引物混合后，在 100 摄氏度下的沸水中煮 5分钟，然后迅 速拿出至于冰

2、块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引 物二聚体就会消 失的 ；理由：引物可能会发生发夹结构 ,自身环化等结构 ,在 100 摄氏度下的沸水中 煮5分钟可使引物变为单链，以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变 性 5min 也同样达到目的，而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚 体。5所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可 以增强特异性；反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下 过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。7. 增加循环数 ；8. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减

3、少， 则考虑增加镁离子浓度 （根据扩增片断长度 而定，片段长则相应镁离子浓度应该 高一些 ）；9. 若降低退火温度， 发现还是只有引物二聚体， 而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l 没有区别，则考虑 Buffer 等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不 对。10. 以上次的PCR产物作模板二次PCR可以提高引物与模板的特异性，减少引 物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释1001000倍，如果间 隔较长可以稀释50100倍。反应成分问题:可能的原因解决办法引物3'端互补重新设计引物引物长度过短增大引物长度引物浓度太高降低引物浓度模板浓度太低提高模板浓度反应条件

4、问题:可能的原因解决办法退火温度不够优化优化退火温度循环数太多减少循环数如何区分引物二聚体与 PCR产物(100kb)(1). PCR产物的电泳检测可能出现那些问题：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性， 酶的质量及，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质， 模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消

5、化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称， 是PCR失败或扩增条带不 理 想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做P

6、CR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异 性，浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行 PCR扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或100ul，应用 多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模

7、索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现 假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合， 或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。弓I物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行

8、PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR方法来减轻

9、或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93 C变性，65 C左右退火与延伸）。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状

10、带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减 少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。（2）。怎么鉴别引物二聚体和产物：1. 实时定量PCRPCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一特定基因在特定组织

11、中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于：如何确定 PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例），为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线（如图1 ）。一般而言

12、，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段， 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物 量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量 与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始 DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置

13、上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT值（threshold value ）（如图2所示）。定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（ t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的

14、对数（如图 3所示）。因些只要获得未知样品 的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。SYBR Green I荧光染料目前荧光实时定量 PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：内嵌染料（SYBR GreenI）、双标记探针、FRET探针、分子信标和 Ampliflor。其中SYBR Green I染料法不需要设 计合成序列特异性探针和新的引物对，是一种简便，性价比较高的实时监测方法， 常常被用于进行RNA表达相对定量以及 DNA定量研究中。SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。

15、SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为 520nm。在PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧 光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微 弱荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。SYBR Greenl在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特 异扩增。此外，由于一个 PCR产物可以与多个分子的染料结

16、合，因此SYBR Greenl的检测灵敏度很高。但是，由于 SYBR Greenl与所有的双链 DNA相结合，因此由引物二聚体、单 链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析 SYBR Greenl Real-Time PCR定量结果。在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔 解曲线时，Real-Time PCR仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过和中 荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样

17、的温度下解链，当产物解链时，SYBR Greenl的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度 变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们不定期可以对P

18、CR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体。以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光 PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及 药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：1、 比较经过不处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等）， 及特定基因在不同相的表达差异。2、 比较正常组织与病理组织中各种mRNA表达量差异。3、验证基因芯片实验结果。4、验证RNA干扰实验结果。2. DXY上的建议：1 .可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率达到1个碱基。可以用非变性丙

19、烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴定®NA在丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围：丙烯酰胺（W/V）:12%有效分离范围（bp）:40-20015% 25-150电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段2. 可以用%TAE的长胶，在30伏的电压下（中号电泳槽），跑16-20小时是应该可以分开 的。3. 用的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看 的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个 半 小时，到两个小时。4. 理论上用或者琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50V跑上2小时左右

20、应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个 Marker也很难来说明你的目的条带和内参带的大小。5. 用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。1。需要单独的垂直电泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝胶。2，具体的做法可以到生物谷网站，有详细的说明。3，你可以用5%的琼脂糖跑一下。6. 建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，以区分拟订目的片段 71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照1材料与方法1. 1 标本人单核细胞系 U937，细胞密度2X 108/

21、L分对照组(N)、处理I组(T1)、处理H组(T 2),N 用 1640 培养基及 10%胎牛血清培养， T1 用 IFN-y 104U/L LPS 1 、T/L用 IFN- 丫 10 U/L LPS 10卩g/分别刺激7 h。1. 2主要试剂与仪器TRIzol 试剂(GIBCO BRL、Fluoro DD 试剂盒(Genomyx)、Supersript n 逆转录酶(GIBCO BRL) Ampli Taq DNA 聚合酶(GIBCO BRL) RNase-free DNasel(Promega);Genomyx LR、 Genomyx SC DNAThermal Cycler(Perkin

22、 Elmer)1. 3 总RNA的制备按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总RNA,以RNase-free DNase 1(终浓度80 000U/L)除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度1. 4 mRNA差异显示.1 逆转录反应选择锚定引物T7(dT12)AP(anchored prime rs , AP)，序列为5' ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTM其中 M = A/G/C. N= A /G/C/T:,以总 RNA 为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA I. 0卩g,AP 4 pmol ,70C

23、5 min,加入50mmol/L Tris- HCl,75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25, dNTRali/x(1 : 1 ： 1 :1), SuperScript n 60 Un its，总反应体系 20 卩。42 C 5 min , 50 C 50 min, 70 °C 15 min。1. 4. 2荧光标记差异显示 PCR 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物质标记的锚定引物TMR-T7(dT12)AP，随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG,3'以逆转录产物 为模板，进行 PCR反

24、应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCI(pH8 . 4) , 50 mmol/L KCl, 3. 75 mmol/L MgCl2，逆转录产物 3. 0 仏 150 卩 mol/L dNTP mi x(1 1 : 1), 0. 35 卩 mol/L 5随机引 物,0. 35 卩 mol/L 3锚定引物，Ampli Taq U nits，总反应体系 10 pl95C 2 min。 94C 15 s, 50C 30 s, 72 C 2 min , 4 个循环； 94C 15 s, 60C 30 s, 72 C 2 min , 25 个循环；72 C 延伸7 min。1. 4. 3分离

25、差异显示片段 配制5. 6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚 0. 2 5 mm,大 小61 X 33 cm 将PCR产物加4. 0 上样缓冲液，95C变性后上样。 3000V、100 W、55 C 电泳4. 5 h。干胶后置于 Genomyx SC扫描，用系统所带的 AcquireSC program软件分 析处 理扫描结果。1. 4. 4回收差异条带用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于 30卩1离子水中，37 C水浴3060 min，备用。1. 4. 5差异条带的再扩增以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer(5'GTAATACGACTC

26、ACTATAGGGC3')反 M13(-48)24-mer(5 ' AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')为引物，进行再扩增反应：模板 卩 1,20 mmol/L Tri&HCI(pH8. 4), 50 mmol/L KCl, 1. 5 mmol/L MgCI2,20 卩 MOJ dNTP mix(1 : 1 ： 1 ： 1), 0. 2 卩 mpf L T7、0 . 2 卩 moI/L M13, AmpIiTaq 1 . 0 U nits，总反应体系20卩1反应条件同差异显示PC R。2结果2. 1 总RNA的质量总RNA经Dnase I处理

27、，用1. 0%甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S 5 S条带，且28 S/18 S约为2 : 1(图1),表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260/OD280比值分别为1 . 92、1 . 83、1 . 98,表明样品纯度高。Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel2. 2 荧光标记 mRNA差异显示结果显示每一泳道均有约50条大小不等的扩增产物，各组间比较见较多呈有无或强弱变化的差异条带，图2中箭头所示。2. 3差异条带再扩增取T2中约1 . 25Kb的条带再扩增，结果见图 3。荧光标记差异显示技术通过对引物设

28、计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差 示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的重叠带”现象减少。DD专用的随机引 物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3'-端以G或C结尾，可增加DD扩增的 效率。通过改 变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达 1. 01. 5kb(图2),因

29、较长的cDNA片段容易通过 Northern blot进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且 其中可提供 更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致4。通常， 再扩 增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为 在锚定引物的5'端和随机引物的3'端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的划线部分)，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成CRNA探针，为CDNA片段的直接测序和鉴定（R

30、PA或Northern分析）提供了方便。用常规的序列分析胶进行分辨时，较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本操作改用5 . 6%的PAGE胶（聚丙烯酰胺），减少胶的厚度（仅250卩m）通过提高电泳的电压 （3000 V）及温度（55 C ），可显著提高分辨率。同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物质标记于锚定引物的 5'端，可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理5、病理过程相关的未知表达基因的研究，相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的作用。军队九五

31、”医药卫生科研基金资助课题 （96M145）7.（附）：凝胶电泳程序：凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种一、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为 6265C,溶解后在 37C下维持液体状态约数小时，主 要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等（一 ）凝胶浓度凝胶浓度的选择依 DNA分子的大小而定 琼脂糖凝胶的浓度与 DNA分离范围 琼脂糖浓度（）线型DNA分子的分离范围（Kb）560120107632（二）电泳

32、缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE和 Tris-磷酸（TPE）.TBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但 TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TBE缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子，从而抑制 DNA酶的活性，防止 PCR扩增产物降解.10XTBE缓冲液的配制Tris 硷，108 克EDTA 克硼酸，55克H20 至，1000ul（其PH应为临用时用水稀至（20倍稀释.（三）核酸电泳的指示剂与染色剂1指示剂：核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色溴酚兰在碱性液体中呈紫兰

33、色，在、1%、和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、和的双链线性DNA片段大致相同二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和的双链线性DNA大致相似指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液载样缓冲液的作用有增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置使样品呈色，使加样操作更方便染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色溴化乙锭（ethidium bromide ,鈔是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下

34、，发出红色荧光根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为ml的EB,有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其 DNA量一般5ng,当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察银染色:银染色液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物， 然后用还原剂如甲醛 使 Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色 也用于 琼脂糖凝胶染色其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收（四）电泳1电泳装置：电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等2电泳方法：（1）

35、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净放在水平桌面上，并架好梳子（2）根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200400bp的DNA片段，可配制浓度的琼脂糖用于电泳3配制电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化冷却至60C（需要时可加入溴乙锭），倒入电泳槽中，待凝固4向电泳槽中倒入，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子如样品孔内有 气泡，应设法除去5在DNA样品中加入体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内6接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）电压为1-5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算

36、）7根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳一般200400bp的PCR产物50V电压，电泳2040min即可（3）溴化乙锭染色后，紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析其装载的样品量大，回收 DNA纯度高长度仅相差（即500bp中的1bp）的核苷酸 分 子即能分离聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N, N, N, N'四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下， 丙烯酰胺聚合形成长链， 聚丙烯酰胺链在交联剂，N , N'一亚甲 双丙烯

37、 酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见表 2.丙烯酰胺（）有效分离范围（bp）溴酚兰*二甲苯青*| |l002000 100 460|80500 65 26060400 45 16040200 30 7025150 15 6010 100 12 45*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目（bp）（一）材料1.电泳仪器：电泳仪，垂直电泳槽及其附件%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N, N'一亚甲基双丙烯酰胺，1克H20,加至 100ml装于棕色瓶内，4C可保存二个月.

38、%过硫酸铵过硫酰铵，1克加水至，10ml4 C可保存一周，-20 C可保存一个月.电泳缓冲液（四甲基乙烯基二胺）（二）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶1按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出2将装好的玻璃电泳板倾斜成 4560 C角3按表3配制所需浓度凝胶的毫升数4加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止5立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会 6室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入缓冲液7小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡9接好电极，电压为 1-8V/cm，进行电泳10. 根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳11. 电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上浸入含ml的溴化乙锭溶 液中，1