生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法

1、第14章 核酸的物理化学性质(Physical and chemical properties of nucleic acid)一、核酸的水解一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交一、核酸的水解 核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。其中糖苷键更易被水解。 核酸的酸水解 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷

2、键。键。DNA在在pH1.6于于37对水透析可完全除去嘌呤碱；对水透析可完全除去嘌呤碱；在在pH2.8于于100加热加热1h，也可完全除去嘧啶碱。，也可完全除去嘧啶碱。 为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲酸（酸（98%100%）密封加热至）密封加热至1752h，无论，无论RNA或或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155加加热热60min（对（对DNA）或）或80min（对（对RNA），嘧啶碱的），嘧啶碱的回收率显著提高。回收

3、率显著提高。 核酸的碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有的核糖上有2OH，在碱作用下形成磷酸三酯。，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2，3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2核苷核苷酸和酸和3核苷酸。核苷酸。 DNA一般对碱稳定，若在一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加中加热至热至100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。酸

4、。RNA的碱水解核酸的酶水解 水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。 核酸酶的分类按底物专一性分类：作用于按底物专一性分类：作用于RNA的称为的称为RNA酶酶（ribonuclease，RNase）；作用于）；作用于DNA的称为的称为DNA酶（酶（deoxyribonuclease，DNase）。）。按

5、对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶（endonuclease）和核酸外切酶（）和核酸外切酶（exonuclease）。）。少数核酸酶既可内切又可外切。少数核酸酶既可内切又可外切。核酸酶的分类按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类，按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类，一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在5位，一类磷酸位，一类磷酸保留在保留在3位。位。作用于双链的为双链酶，作用于单链的为单链酶。作用于双链的为双链酶，作用于单链的为单链酶。核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割

6、的，也有方向切割的，也有35方向切方向切割的，分别称为割的，分别称为53外切酶和外切酶和35外切酶。还有外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的（限制性内切对特定核苷酸序列部位进行切割的（限制性内切酶）。酶）。 二、核酸的酸碱性质碱基的解离碱基的解离胞嘧啶的解离胞嘧啶的解离碱基的解离尿嘧啶的解离尿嘧啶的解离胸腺嘧啶的解离胸腺嘧啶的解离碱基的解离腺嘌呤的解离腺嘌呤的解离鸟嘌呤的解离鸟嘌呤的解离核苷的解离 核苷中由于戊糖的存在，碱基的解离核苷中由于戊糖的存在，碱基的解离常数有所下降，说明糖的存在增强了碱基常数有所下降，说明糖的存在增强了碱基上可解离基团的酸性。上可解离基团的酸性。核苷酸的解离核酸

7、中磷酸基的解离核苷酸的解离曲线核苷酸的解离曲线尿苷酸的碱尿苷酸的碱基的碱性极基的碱性极弱，实际上弱，实际上测不出其含测不出其含氮环的解离氮环的解离曲线，故不曲线，故不能形成兼性能形成兼性离子。离子。小牛胸腺DNA的滴定曲线从中间往从中间往两边滴为两边滴为曲线曲线，非缓冲区非缓冲区较宽。较宽。从两边往从两边往中间滴为中间滴为曲线曲线，非缓冲区非缓冲区较窄。较窄。这种情况是这种情况是DNA双链分子双链分子解链导致的解链导致的三、核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸、核酸在苷、核苷酸、核酸在240290nm有强烈的吸收，有强烈的吸收，

8、最大吸收值在最大吸收值在260nm附近。附近。 紫外吸收是实验室中最常用的定量测定紫外吸收是实验室中最常用的定量测定DNA或或RNA浓度的方法。对于纯的样品，只要测出浓度的方法。对于纯的样品，只要测出260nm的的A值即可计算出浓度。通常值即可计算出浓度。通常A值为值为1相当相当于于50g/ml双链双链DNA，或，或40g/ml单链单链DNA或或RNA。 测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度。测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度。纯纯DNA的的A260/A280应大于应大于1.8，纯，纯RNA应达到应达到2.0。若低于此值说明含有杂质。若低于此值说明含有杂质。四种核苷酸的紫外吸收曲线摩尔磷

9、吸光系数 有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶表示。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数。系数。 式中式中A为测得的吸光度，为测得的吸光度，c为磷的浓度，为磷的浓度，L为比为比色杯的厚度，色杯的厚度，W为每升溶液中磷的重量（克）。为每升溶液中磷的重量（克）。 WLAcLAP98.30)(DNA的增色效应和减色效应 一般天然一般天然DNA的的(P)为为6600，RNA为为77007800。单链核酸的。单链核酸的(P)

10、比双链核酸的大，比双链核酸的大，核苷酸单体的核苷酸单体的(P)更大。双链更大。双链DNA变性成单链变性成单链后后(P)值增大，称为增色效应；复性后值增大，称为增色效应；复性后(P)值减值减小，称为减色效应。这是因为双链结构使碱基小，称为减色效应。这是因为双链结构使碱基对的对的电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 DNA的紫外吸收光谱1.天然天然DNA2.变性变性DNA3.核苷酸总核苷酸总吸光度值吸光度值四、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性核酸的变性 核酸的变性就是双链之间的氢键断裂，成核酸的变性就是双链之间的氢键断裂，成为单链。变性主要是双链为单链。变性

11、主要是双链DNA变成单链，也可变成单链，也可以是单链以是单链RNA分子内的局部双链变成单链。使分子内的局部双链变成单链。使核酸变性的因素有高温、过酸过碱、变性剂等。核酸变性的因素有高温、过酸过碱、变性剂等。常用的核酸变性剂有尿素、甲醛。常用的核酸变性剂有尿素、甲醛。 DNA变性示意图DNA分子的熔点Tm 在在DNA分子的热变性中，随着温度的升高，分子的热变性中，随着温度的升高，当温度达到一定值后，双链开始解开，然后有当温度达到一定值后，双链开始解开，然后有一个迅速的解链，成为无规线团，变性的温度一个迅速的解链，成为无规线团，变性的温度区间很窄，我们把双链区间很窄，我们把双链DNA解开一半时所需

12、的解开一半时所需的温度称为该温度称为该DNA的熔点（的熔点（Tm）。）。DNA的的Tm一一般在般在8295之间。之间。 DNA分子的热变性曲线分子的热变性曲线DNA分子的热变性曲线 异质的异质的DNA变性温变性温度范围宽，度范围宽，均质的均质的DNA变性温度范变性温度范围窄。围窄。bacterial DNAViral DNA影响DNA分子Tm的因素（1）GC含量：含量：GC之间有之间有3个氢键，所以个氢键，所以GC含量越高含量越高Tm越高。通过测定越高。通过测定Tm值，可以推值，可以推算出算出DNA中中GC的含量，其经验公式为的含量，其经验公式为:44. 2) 3 .69(TmxCG影响DNA

13、分子Tm的因素（2）介质中的离子强度：一般说离子强度低）介质中的离子强度：一般说离子强度低时时Tm低，变性温度范围较宽；离子强度高时低，变性温度范围较宽；离子强度高时Tm高，变性温度范围较窄。高，变性温度范围较窄。 GC对含量与熔点的关系Pneumococcus 肺炎链球菌肺炎链球菌S. Marcescens粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌M. phlei草分支杆菌草分支杆菌GC对含量与熔点的关系RNA的热变性曲线 RNA只有局部的双螺旋，所以其只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变较低，变性温度范围较宽。不管是性温度范围较宽。不管是DNA还是还是RNA，加入甲，加入甲酰胺可降低其酰胺可降低其Tm值。双

14、链值。双链RNA的变性曲线几乎与的变性曲线几乎与双链双链DNA相同。相同。 1.一种浮萍的一种浮萍的18SrRNA2.酵母的杀伤酵母的杀伤RNA（双（双链）加甲酰胺链）加甲酰胺3.同同2，但无甲酰胺，但无甲酰胺DNA的复性 变性变性DNA在适当条件下，可以使两条分开的在适当条件下，可以使两条分开的单链重新缔合成双链单链重新缔合成双链DNA，这个过程称为复性，这个过程称为复性（renaturation）。将热变性的单链）。将热变性的单链DNA骤然冷却，骤然冷却，DNA不能复性，只有缓慢降温才能使热变性的不能复性，只有缓慢降温才能使热变性的DNA复性，这个过程又称为退火（复性，这个过程又称为退火（

15、annealing）。）。不同DNA的复性曲线核酸杂交 核酸杂交是以已知的异核酸杂交是以已知的异源源DNA或或RNA片段为探针，片段为探针，检测与之互补的检测与之互补的DNA或或RNA的的存在。多数情况下是对存在。多数情况下是对探针进行标记，少数情况下标记的是被检测的探针进行标记，少数情况下标记的是被检测的DNA或或RNA。第15章 核酸的研究方法(Research methods of nucleic acid)一、一、核酸的分离、提纯和定量测定核酸的分离、提纯和定量测定二、二、核酸的超速离心核酸的超速离心 三、核酸的三、核酸的凝胶电泳凝胶电泳 四、四、核酸的核苷酸序列测定核酸的核苷酸序列测

16、定五、五、DNA聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）六、六、DNA的化学合成的化学合成 一、核酸的分离、提纯和定量测定DNA的分离的分离 真核生物细胞中的染色体真核生物细胞中的染色体DNA与碱性的组蛋白与碱性的组蛋白结合在一起，成为核蛋白（结合在一起，成为核蛋白（DNP），），DNP溶于水和浓溶于水和浓盐溶液（如盐溶液（如1mol/L NaCl），但不溶于生理盐水），但不溶于生理盐水（0.14mol/L NaCl）。利用这一性质，可将细胞破碎）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14mol/L，使，使DNP纤维沉淀出来。用玻璃棒将纤维

17、沉淀出来。用玻璃棒将DNP纤维缠绕在棒上，纤维缠绕在棒上，再经多次溶解和沉淀以纯化再经多次溶解和沉淀以纯化DNP。 DNA的分离 用水饱和的苯酚抽提，用水饱和的苯酚抽提，DNA溶于上层水相，溶于上层水相，变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相变性蛋白质沉淀于两相的界面上或停留在酚相中。如此反复操作以除净蛋白质。将含中。如此反复操作以除净蛋白质。将含DNA的的水相合并，在有盐的条件下加水相合并，在有盐的条件下加2倍体积的冷乙醇，倍体积的冷乙醇，将将DNA沉淀出来，用乙醚或乙醇洗涤沉淀。用沉淀出来，用乙醚或乙醇洗涤沉淀。用此方法可得到纯的此方法可得到纯的DNA。 用用RNase处理除去残留的处理

18、除去残留的RNA 。为了得到。为了得到大分子的大分子的DNA，应防止核酸酶和机械力对，应防止核酸酶和机械力对DNA的破坏。的破坏。RNA的分离 分离分离RNA时要特别注意防止时要特别注意防止RNase对对RNA的降的降解。解。RNase无处不在，且耐高温，不易灭活。无处不在，且耐高温，不易灭活。 制备制备RNA通常需要注意通常需要注意3点：点：所有用于制备所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温烘烤，的玻璃器皿都要经过高温烘烤，塑料用具须经高压灭菌，不能高压灭菌的器具要用塑料用具须经高压灭菌，不能高压灭菌的器具要用0.1%焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，

19、DEPC，RNase的不可逆抑制剂）浸泡处理，再煮沸以除净的不可逆抑制剂）浸泡处理，再煮沸以除净DEPC。在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂（如盐在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂（如盐酸胍）。酸胍）。在提取和纯化在提取和纯化RNA的试剂中加入的试剂中加入RNase的抑制剂的抑制剂（如（如RNasin）。）。 RNA的分离方法 目前最常用的制备目前最常用的制备RNA的方法有两个：的方法有两个：1用酸性胍盐提取，然后用苯酚和氯仿多次抽用酸性胍盐提取，然后用苯酚和氯仿多次抽提除去蛋白质。异硫氰酸胍是极强烈的蛋白质变提除去蛋白质。异硫氰酸胍是极强烈的蛋白质变性剂。此法用于小量制备性剂。此法用于小

20、量制备RNA。2用胍盐用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度心。蛋白质密度1.89g/cm3，沉在底部。，沉在底部。 分离分离poly(A)+ RNA通常采用寡聚胸腺嘧啶脱通常采用寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸亲和层析法。氧核苷酸亲和层析法。 核酸含量的测定紫外分光光度法紫外分光光度法定磷法定磷法定糖法定糖法 二、核酸的超速离心核酸密度的测定核酸密度的测定 将将8.0mol/L的的CsCl装入离心管中，装入离心管中，DNA样品溶样品溶于于CsCl溶液，加在离心管顶部。以溶液，加在离心管顶部。以45000转转/分的速分的速度离心度离心16小时以上，此时离心

21、管中形成线性的小时以上，此时离心管中形成线性的CsCl密度梯度，底部为密度梯度，底部为1.80g/cm3，顶部为，顶部为1.55g/cm3。DNA样品带停留在与之密度相应的位置。根据此位样品带停留在与之密度相应的位置。根据此位置的置的CsCl密度，可知密度，可知DNA的密度。的密度。 核酸密度的测定 也可用一已知密度的也可用一已知密度的DNA与待测密度的与待测密度的DNA一一起离心，根据两条带的位置及已知起离心，根据两条带的位置及已知DNA的密度，计的密度，计算出待测算出待测DNA的密度。的密度。 式中式中和和0分别为待测分别为待测DNA和标准和标准DNA的密度，的密度，r和和r0分别为待测分

22、别为待测DNA和标准和标准DNA区带位置与离心轴区带位置与离心轴心的距离，心的距离，为角速度（弧度为角速度（弧度/秒）。秒）。 102022010)(2 . 4rr测定DNA中GC含量 含含GC多的多的DNA密度大，密度大，DNA中中GC的百分含量与其浮力密度呈正比，所以测出了的百分含量与其浮力密度呈正比，所以测出了DNA的浮力密度就可以计算出其的浮力密度就可以计算出其GC百分含百分含量。量。 658. 1100. 0CGx100. 0658. 1CGxDNA中G-C含量与密度的关系Salmon sperm 鲑鱼精子鲑鱼精子Pneumococcus 肺炎链球菌肺炎链球菌Serratia沙雷氏菌沙雷氏菌M. Phlei草分支杆菌草分支杆菌溶液中核酸构象的研究 RNA只有局部双螺旋，它的浮力密度比双只有局部双螺旋，它的浮力密度比双链链DNA高，双链高，双链DNA又比蛋白质的密度高，又比蛋白质的密度高，双链双链DNA变性后成为单链，密度增加。利用密变性后成为单链，密度增加。利用密度梯度离心可以研究核酸分子的构象变化及其度梯度离心可以研究核酸分子的构象变化及其动力学过程。动力学过程。 纯化核酸 离心时加入溴离心时加入溴化乙锭，离心后用化乙锭，离心后