谷胱甘肽的分离与制备

1、谷胱甘肽的分离与制备摘要：谷胱甘肽（GSH）是一种活性功能性成分，具有良好的保健作用。本文介绍了GSH的生产现状，综述了GSH的分离制备方法。关键词：谷胱甘肽（GSH）、分离、粗提、精制、高纯度制备The Separation and Preparation of GlutathioneAbstract：Glutathione (GSH) is a function of active ingredient, which has a good health care. This article describes the production status of GSH, and o

2、verview the methods of separation and preparation of GSH.Keyword：Glutathione (GSH); separation; preparation; crude extraction; refined；preparation of high purity 谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的含巯基的生物活性三肽化合物, 以还原态(GSH)和氧化态(GSSG)两种形态存在。GSH有多种生理功能, 对维持生物体内适宜的氧化还原环境尤为重要, 临床用于中毒性和感染性肝炎的治疗、有机物及重金属的解毒、癌症辐射和化疗的

3、保护，而GSSG没有生理功效，因此在分离时需要注意防止其氧化。目前GSH 的主要生产厂家有J. T. Baker、 BDH、 Fluka、 E. Merck、 Riedel- deHaen、 Sigma 及日本和光纯药等国外公司1 。实现GSH的国产化, 不仅可改变我国谷胱甘肽原料药依赖进口的局面, 而且对我国医药工业、临床医学和食品工业均具有重大的社会效益和经济效益。值得注意的是2011年由江南大学生物发酵与分离实验室独立研制成功了高纯度还原型、氧化型GSH生产工艺，项目在优良菌种的选育、培养基组成的优化、高密度发酵及GSH亲和层析分离等方面取得了重大突破。生产出高纯度还原型、氧化型谷胱甘肽

4、，产品达到国外同类产品标准。项目已经完成了中试，具备了产业化的条件。该项目的实施，打破GSH长期被国外大公司垄断生产的行业格局，实现国内产业化生产GSH零的突破。1. 谷胱甘肽的生产制备现状2谷胱甘肽的生产方法很多，有化学合成法、萃取法、酶法和发酵法等。工业上则采取化学合成法来生产谷胱甘肽，即谷氨酸、半脱氨酸、甘氨酸缩合成谷胱甘肽。但是化学合成的谷胱甘肽是消旋体，分离十分困难，造成产品纯度不同，其生物效价很难保持一致。目前谷肤甘肤的化学合成生产工艺已较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且存在环境污染等问题。萃取法主要是从高含量谷胱甘肽的动植物组织中提取所采用的一种

5、方法，它是发酵法生产流程中的下游过程基础。可以从鼠血，鼠肝和鸡血，酵母，麦芽中提取GSH，但以酵母作原料居多。萃取法生产GSH所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等。用以上方法制取GSH，纯度和收率不高。其基本工艺如下：酶法合成由于酶促反应具有催化专一性强，反应条件温和，转化效率高等优点，因此国际上多采用此法生产。酶法生产就是利用生物体内的天然谷胱甘肽合成酶，以谷胱甘肽的前体L-谷氨酸、L-半肤氨酸及甘氨酸为底物，并添加少量三磷酸腺普通过逆反应合成谷胱甘肽。生物体酶法生产谷胱甘肽的研究内容主要包括选育高表达的生产菌株，固定化材料的选择，怎样构建一个高效的ATP再生系统，优化生产工艺，改进分离

6、纯化技术等。用固定化细胞(酶)作为GSH生物合成系统具有生产过程简化、生产效率提高等优点。此外对于基因工程菌而言，固定化培养与传统的培养方式相比也具有一定优势，如工程菌的稳定性问题有可能得到较好解决、在稀溶液体系中具有较高的细胞浓度、克隆可长期生产、细胞可得到介质的保护、有时无需进行产物分离、反应器中可积累高浓度产物、较好的传质特性、便于自动控制等。其工艺流程如下：日本很早就对发酵法生产谷胱甘肽进行了研究。发酵法生产GSH就是选育(或构建)GSH合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等，最终提高GSH的产率和质量。但是发酵法生产谷胱

7、甘肽的问题是转化效率低，是由于正常情况下微生物细胞内的表达水平低，因此选育具有高谷肤甘肤合成能力的菌株是提高谷胱甘肽合成效率的关键。发酵法使用的一般是酵母，从酵母中提取谷肤甘肤的工艺流程如下：2. 谷胱甘肽的分离提取2.1 粗提粗提的方法有很多，主要有渗透法（如热水抽提、甲酸抽提、乙酸抽提、硫酸抽提等）和对羟基苯甲酸丙酯法。邱雁临等3比较了用渗透法（热水）抽提和对羟基苯甲酸丙酯法提取谷胱甘肽，实验证明了渗透法抽提GSH 比对羟基苯甲酸丙酯法更优越。而周楠迪等4比较了热水抽提、甲酸抽提、乙酸抽提、硫酸抽提等抽提方法，得出结论：热水抽提法从酵母中提取GSH的效率最高 ，耗时最少，经济、无污染，是从

8、酵母中提取GSH的首选方案。王晓菊等5在热水抽提实验基础上，通过L9(43)正交实验，对从巴斯德毕赤酵母提取还原型谷胱甘肽(GSH)的实验进行优化，得到了最佳提取条件：15 的物水质量体积比，沸腾15 min，加入1%的高氯酸后静置1.5 h。实验结果表明：在热水沸腾15 min 后，溶液中GSH 含量为67 mg/100 mL；加入1%高氯酸后，GSH 平均浓度提高到152 mg/100 mL。加入的高氯酸主要是为了将细胞完全破碎，使胞内的GSH 基本上全部释放到水溶液中。但是需要注意的一点是，由于细胞内的全部氨基酸、蛋白质等溶于热水中，提高了分离得到高纯度GHS的难度。2.2 谷胱甘肽的精

9、制：吴祥庭等6采用双水相分配结合温度诱导法分离谷胱甘肽, 收率可达80%, 但是GSH 与蛋白质、氨基酸的分离效果不理想。由于电渗析具有分离条件比较温和，适于工业化生产等，电渗析也成为分离GSH的方法之一。Takeshi Gotoh7等通过电渗析法分离GSH和谷氨酸取得了很好的效果，但是产率较低。为此他测定日本Selemion公司AMV型阴离子交换膜对GSH和谷氨酸的吸附情况发现，用DDT洗脱后，两者的收率大大增加，说明膜受到了GSH的污染，原因可能为GSH巯基与膜氧化后结合。这一缺点限制了电渗析法在GSH中的使用。之后Takeshi Gotoh8考虑要纳滤分离谷胱甘肽。在酶法生产GSH时，由

10、于酶催化存在平衡，这就需要将GSH及时从基液中分离出去。为此他考虑用NTR-7450纳滤膜（磺化聚醚砜选择性层，带负电）对GSH以及相应的L-谷氨酸，L-半胱氨酸，甘氨酸，L-谷氨酰胺等氨基酸进行分离，从而使酶催化反应得以持续进行。在实验中，其研究了PH、二价金属离子浓度、氨基酸浓度对纳滤效果的影响。在单组分实验中发现：NTR-7450膜对电解质的排斥力与电解液中阴离子比率相关，并且随着PH的变化而变化。在PH=7.4左右，GSH与这些氨基酸对膜的排斥力差异最大，对GSH的截留率达到100%，而对L -半胱氨酸，甘氨酸，L -谷氨酰胺的截留率低于30%。在二价金属盐存在的条件下，膜的截留率随着

11、盐浓度的提高而下降，这可能是因为带负电的电解质通过与金属离子形成中复杂化合物而部分中和。在多组分系统中，在分别存在1.0, 2.0, 5.0mM 的L -谷氨酰胺，甘氨酸，L -半胱氨酸的条件下，不同浓度（0.1 到5.0mM）的GSH被膜完全阻隔，同时膜对氨基酸的排斥力随着氨基酸浓度的升高而降低。这说明纳滤也许可以用于从酶作用底物、L -半胱氨酸，甘氨酸，L -谷氨酰胺中分离GSH。由于离子交换树脂具有分离效果高、选择性高、操作简单、成本低等特点，受到研究者的青睐，目前研究用离子交换树脂分离GSH是最多的。胡晓梅9等研究001×7 阳离子交换树脂分离纯化谷胱甘肽的工艺条件，考察了0

12、01×7 阳离子交换树脂对GSH 的静态吸附量，以及洗脱时洗脱液种类、洗脱浓度、洗脱流速等对分离纯化产品GSH 的影响。确定其工艺流程；最适上柱pH 为2.5，洗脱液NaC1 溶液最适洗脱浓度为1.2%，洗脱流速为2.0ml/min；收集洗脱液，用紫外分光光度法检测其GSH 的浓度，回收率为75，纯度相对提高60。 由于酵母提取液中含有大量的蛋白质、肽类、氨基酸、核苷酸等多种杂质，特别是一些寡肽和氨基酸，由于其结构特征和性质与GSH接近，往往会影响离子交换效果。王焱10等通过超滤除去一些大分子肽后再比较其在D001阳离子交换树脂上吸附效率后发现，吸附效率从原来的40%左右提高到70%

13、以上。对于一般的离子交换树脂而言，其选择性并不高。而赵睿等11用大孔苯乙烯树脂改性合成了含硫树脂，通过其对GSH 的分离，纯度可以达到90% , 且操作步骤简单。研究结果表明采用pH3.0 的缓冲液进行吸附, 自制的含硫树脂最大吸附容量可达22mg/ g湿树脂, 选择质量浓度为0.5%的NaOH 溶液洗脱GSH, 解吸率可达70%以上。采用真实发酵液进行分离纯化, 收率为35%, 纯度可达90% 以上。在这个基础上，赵睿等12又考虑用金属螯合亲和色谱对GSH进行分离。亲和色谱的色谱柱为结合有Zn2+的硫脲柱，通过Zn2+与GSH特异性基团进行结合，达到分离的目的，之后用硫脲洗脱得到产品。通过参

14、数优化后，收率为91.22%，纯度为60.03%，并且用2mol/L的NaCl清洗流动相可以清除杂质对柱的非特异性结合，提高GSH的纯度。2.3 高纯度谷胱甘肽的制备传统的高纯度谷胱甘肽制备方法为铜盐沉淀结晶法，卓肇文13等用碾碎的732离子交换树脂，筛选60-80目组分用于吸附酵母热抽提液中的GSH，之后用1mol/L的硫酸进行洗脱，用新鲜的Cu2O沉淀CuGS。然后通入H2S，将铜离子去除，生成GSH。最后将含有GSH的溶液通N2减压浓缩得到GSH结晶，总回收率为40%，含量为99%。但残留的铜等重金属离子会对GSH 造成污染, 不宜应用在食品医药领域。随着科技的进步，色谱应用的越来越广泛

15、。对于高效液相色谱（HPLC）和超压薄薄层色谱，其具有分离程度高、检测灵敏度高、选择性好等特点，在很多的GSH分离方法中都将其作为含量测定基准方法，用于评价其他方法分离效果14。但是由于它们的分离成本比较高，难以实现工业化生产，故在实际工业应用上较少使用。而模拟移动床色谱(Simulated Moving Bed Chromatography，简称SMB)却具有分离能力强、设备体积小、投资成本低、环境污染少、便于实现自动控制等优点，特别有利于分离热敏性物质及难分离的物系。该技术最早应用于石化领域，近年来，越来越受到工业界和研究者的关注，在食品工业中的应用研究不断深入15。日本早在上世纪80年代

16、就开始研究应用模拟移动床色谱分离GSH和谷氨酸。HARUHIKO MAKI16等首先研究了其分离的数学模型和色谱条件，然后通过计算机控制独特设计的多端口旋转阀来定时切换有机溶剂流动相的循环流动方向，从而周期性改变物料的进出口位置，以此来模拟固定相与流动相之间的逆流移动，实现组分之间的连续分离。所用的色谱柱为阳离子交换柱，用HCl洗脱，得到的纯度和产率系数都可以达到99%，得到的GSH浓度和产率分别为单独使用时的10倍和18倍，因此可以用于工业化分离高纯度的GSH。3. 启发 随着人们生活水平的提高，谷胱甘肽(GSH)作为一种具有天然保健功能的功能性因子必将受到广泛的关注。根据现有的研究报道，尽

17、管已对谷胱甘肽生产菌的选育与改良、发酵过程的优化控制等进行了广泛的研究，但是真正能够实际生产应用的比较少。为了提高发酵法生产谷胱甘肽的竞争力,今后的研究工作应集中于:(1)选育或通过基因重组的方法获得GSH的高产酵母菌株,提高它的合成酶系的表达水平,并使之在胞内大量积累; (2)发酵条件的对产率的影响，包括培养基的选择、温度、PH、氧气等等; (3)GSH的分离方法的创新性改进;（4）加强对产品的研发和生产投入，将已有的研究成果尽快应用于实践，在实践中不断发现问题、解决问题，摸索出一条经济效益高、污染小、能耗低的工艺路线，摆脱对国外公司的依赖。参考文献：1潘飞, 邱雁临. 离子交换树脂纯化还原

18、型谷胱甘肽(GSH) 的研究J. 生物技术, 2006,16（4）:38-41.2谢雷波. 利用酿酒酵母生物合成谷胱甘肽及其分离纯化的初步研究, 学位论文. 20063邱雁临, 胡静, 陈靓, 孙正博. 从酵母中分离纯化谷胱甘肽（GSH）新方法J. 食品工业科技, 2007,28（3）：134-136. 4周楠迪, 李寅, 陈坚, 阮文权, 伦世仪. 从酵母中提取谷胱甘肽的初步研究J . 生物技术1997,7（4）：30-33.5 王晓菊, 傅力, 王纯利. 从巴斯德毕赤酵母中分离纯化还原型谷胱甘肽J. 食品科技 2009,34（1）：183-186.6吴祥庭, 徐帅. PEG/四水合酒石酸钾

19、钠双水相法萃取发酵液中的谷胱甘肽J. 中国食品学报,2010,10（2）：83-88.7Takeshi Gotoh, Ken-ichi Kikuchi .Contamination of an anion-exchange membrane by glutathione J. Bioseparation, 20009: 3741.8Takeshi Gotoh, Hisashi Iguchi, Ken-Ichi Kikuchi. Separation of glutathione and its related amino acids by Nan filtration J. Biochemic

20、al Engineering Journal, 2004, 19:165170.9胡晓梅, 黄娟, 舒媛, 许铁成. 离子交换树脂分离纯化谷胱甘肽的研究J. 发酵科技通讯 ,2008，34（4）：20-22.10王焱, 苏晓晋. Candida utilis 提取液的组成对D001阳离子交换树脂分离谷胱甘肽效率的影响J. 食品科学, 2007,28（05）：59-62.11 赵睿, 王满意, 周鑫, 谭天伟. 含硫树脂的制备及在谷胱甘肽分离中的应用J. 北京化工大学学报, 2007,34（3）:304-307.12Rui Zhao, Tianwei Tan. Purification of Glutathione by Immobilized Metal Ion