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文档简介

1、哺乳细胞蛋白表达案例哺乳细胞蛋白表达案例1. 实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过哺乳表达体系获得目的蛋白X。2. 实验设计（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体pAZ-V5，构建表达质粒pAZ-V5-X；（3）转染293F细胞进行蛋白表达，通过Western Blot检测蛋白X是否表达；（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白X，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。3. 蛋白分析（1）经EditSeq翻译目的蛋白X序列：m.w.=39.27kd，pI=8.52（2）经UniProt匹配，蛋白X物种来源：草鱼（3）目的基因稀有密码

2、子分析及蛋白结构分析目的基因稀有密码子分析蛋白亲疏水分析 蛋白跨膜结构域分析 蛋白信号肽预测分析结果：目的基因不含哺乳表达体系稀有密码子。目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列。结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pAZ-V5上，利用载体自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白C端添加His标签便于纯化。4. 表达载体构建4.1 pAZ-V5-X质粒酶切验证：钟鼎特色载体pAZ-V5酶切鉴定Marker: 250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,8000,12000Line1:酶切前质粒Line2: 酶切后质粒基因名称：X（OD2

3、60/OD280:1.82）酶切位点：EcoRI/BamHI4.2 pAZ-V5-X质粒测序验证：部分序列比对结果图5. 蛋白表达及纯化纯化蛋白Western Blot鉴定分析M: 蛋白质分子质量标准1: 纯化蛋白蛋白表达 Western Blot鉴定分析M: 蛋白质分子质量标准1: 细胞裂解上清2: 细胞上清3: 细胞裂解上清（阴性）4: 细胞上清（阴性）纯化蛋白X SDS-PAGE胶灰度值分析 纯化蛋白X SDS-PAGE(reduced)分析M: 蛋白质分子质量标准1: 纯化蛋白6. 蛋白内毒素检测凝胶半定量试验：平行管供试品稀释倍数阴性对照阳性对照反应终点稀释倍数Log10平均值Log10-11:21:41:81:161:321:641+-+1:2（0.5）-0.301-0.3010.5（1：2）2+-+1:2（0.5）-0.301纯化蛋白内毒素浓度=鲎试剂灵敏度×反应终点稀释倍数的几何平均值 =0.03EU/ml×2=0.06EU/ml7. 实验结论目的蛋白X在293F细胞中得到表

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