细胞工程实验

1、细胞工程实验一、课程名称：细胞工程实验Cell Engineering Experiment 二、实验课性质：独立设课三、适用专业：生物技术四、采用教材及参考书司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安：世界图书出版社，1996李志勇. 细胞工程. 北京：科学出版社，2003冯怀亮.哺乳动物胚胎工程. 长春：吉林科学技术出版社，1994五、学时学分课程总学时：36；课程总学分：1；实验课总学时：36六、实验项目名称和学时分配序号实验项目名称学时分配实验属性实验类型实验者类别每组人数必开/选开1动物细胞培养液的配制及灭菌4基础类验证性本专科1必开2动物细胞的组织块培养法4基础类验证性本专科1必开3动物

2、细胞的消化培养法4基础类综合设计性本专科1必开4动物细胞的传代培养8基础类设计性本专科1选开5细胞基本参数观察4基础类验证性本专科1选开6细胞的超低温冻存,复苏4基础类综合设计性本专科1选开7动物细胞的活性测定4基础类综合设计性本专科1选开8培养细胞的染色体标本制备与分带技术4基础类验证性本专科1选开9小鼠的免疫试验和用于融合细胞饲养层细胞的制备4基础类综合设计性本专科1必开10骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的制备4基础类综合性本专科1选开11细胞融合4基础类综合设计性本专科1选开12杂交瘤细胞选择和克隆化培养4基础类综合设计性本专科1选开13血清制备或抗血清制备和抗体的检测试验6基础类综合性本专科1

3、选开14单克隆抗体的制备与分离纯化6基础类综合设计性本专科1选开15小鼠超数排卵技术小鼠和胚胎移植6基础类综合性本专科1选开16小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养及胚胎干细胞滋养层的制备4基础类验证性本专科1选开17小鼠胚胎干细胞（ES）的体外培养8基础类综合性本专科1选开18植物组织与细胞培养基的配制与灭菌4技术基础类验证性本专科2选开19外植体的消毒与愈伤组织诱导4技术基础类验证性本专科2选开20植物悬浮细胞系的建立4技术基础类设计性本专科2选开21原生质体的分离与培养6技术基础类设计性本专科1选开22细胞凋亡的诱导及生化检测6技术基础类综合性本专科1选开23流式细胞术分选血细胞试验动物6

4、基础类综合性本专科1选开24动物细胞大规模培养技术8技术基础类综合性本专科1选开25植物细胞大规模培养技术8技术基础类综合性本专科1选开七、实验教学的目的和要求细胞工程是一门综合多种学科和技术的新兴学科，也是一门为多门学科提供实验依据的学科，与生物学、化学和工程学等基础学科紧密相关。既然是一门以实验学科为主的一门科学，其实验结果就显得尤其重要。实验的结果好坏，与实验的准备和实验的过程有关。在实验准备阶段，首先要做好计划，包括：做什么，怎样做，用什么做，实验程序是什么，关键程序是什么，这些都要做到心中有数，然后进行准备。在实验的实施阶段，就要根据计划所列的程序进行操作，尽管有一些变化，但变化以不

5、会使计划乱套为准绳。每一门科学有着科学发展的总规律，即从低级到高级逐渐发展的完善过程；每一门科学都有着自身发展的个性规律。对于细胞工程来这一实验为主的学科来说，其内容就由较低级的基础实验和由应用较高价值精密仪器进行的高级实验组成。也许有的同学瞧不起低级的实验，但请不要忘记这些实验是基础。没有这些基础实验的磨练，其科学素养难以塑造成功。有了基础，有了科学素养，再进行其他实验也就相对自由了，自如了。目的：学习动物细胞培养技术、动物细胞培养技术、杂交瘤技术与单克隆抗体制备、哺乳动物早期胚胎细胞和干细胞的活体观察与体外培养技术，以及细胞工程相关综合技术。锻炼学生的动手验证能力，开拓学生的思维能力，培养

6、学生的科学素养，使自己具备能够进行独立设计、实施和完成科学实验的能力。要求：学生应按照先简后繁、先易后难的顺序进行实验操作。 掌握实验室和工程化生产的技术要点，掌握动物细胞培养技术、动物细胞培养技术、杂交瘤技术与单克隆抗体制备技术和小鼠胚胎工程技术，了解哺乳动物早期胚胎细胞和干细胞的活体观察与体外培养技术，以及细胞工程相关技术。八、实验项目的内容和要求1动物细胞培养液的配制及过滤除菌实验内容：1.1、动物细胞培养液的配制PBS，DMEM，1640，TCM，MEM1.2、培养基的过滤除菌和高压灭菌PBS，DMEM，1640，TCM，MEM实验要求：掌握配制人工合成动物培养液（基）；掌握过滤灭菌和

7、高压灭菌应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13CO 2培养箱24超净工作台42动物细胞的组织块培养法实验内容：2.1皮肤的原代培养（组织快法）2.2肝脏细胞培养（组织快法或消化法）实验要求：掌握动物常见组织皮肤，胚胎成纤维细胞，肝脏，肾脏取材的要点，掌握组织块培养法，了解实验初步设计。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13CO 2培养箱33倒置显微镜2一台进口，配自动摄像装置5超净工作台46离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头7显微镜253动物细胞

8、的消化培养法实验内容：3.1肝脏或胚胎成纤维细胞培养3.2肾脏细胞培养3.3表皮细胞消化培养实验要求：掌握动物皮肤，胚胎成纤维细胞，肝脏，肾脏取材的要点，掌握常见的化学消化法和酶消化法步骤，熟悉常用的试剂，了解实验初步设计。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13CO 2培养箱33倒置显微镜2一台进口，配自动摄像装置5超净工作台46离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头7显微镜254动物细胞的传代培养实验内容：4.1皮肤的传代培养4.2胚胎成纤维细胞培养4.3肝脏细胞培养4.4肾脏细胞培养4.5细

9、胞系的传代实验要求：掌握动物皮肤，胚胎成纤维细胞，肝脏，肾脏传代的要点，了解实验设计优化。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13CO 2培养箱23倒置显微镜2一台进口，配自动摄像装置5超净工作台46离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头5培养细胞基本参数观察实验内容：5.1细胞的分裂指数培养细胞每24h消化细胞染色细胞固定细胞细胞记数绘制细胞的分裂指数图分析结果5.2生长曲线测定培养细胞每24h消化细胞细胞记数绘制细胞的分裂指数图分析结果实验要求：掌握实验法绘制细胞生长曲线和测定细胞分裂指数，验

10、证细胞的不同生长时相和不同细胞生长曲线的不同。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅250L3CO 2培养箱23倒置显微镜2一台进口，配自动摄像装置5超净工作台46离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头7显微镜258冰箱2-20 6细胞的超低温冻存,复苏实验内容：6.1常规超低温冻存甘油法，DMSO法，乙二醇法6.2玻璃化超低温冻存甘油法+DMSO法+乙二醇法实验要求：掌握不同的细胞冷冻方法，掌握设计冷冻程序，比较冷冻效果掌握冷冻细胞的活性测定的基本方法，掌握酶标仪的使用以及设定对照。应配备的主要设

11、备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13程序冷冻仪14CO 2培养箱25倒置显微镜3一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48酶标仪1进口，连续波长9离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头10双目显微镜257细胞的活性测定实验内容：7.1台盘兰染色7.2伊红Y染色7.3荧光染色消化细胞（或解冻细胞）调整细胞浓度荧光素处理孵化离心观察或测定7.4 MTT染色消化细胞调整细胞浓度MTT处理孵化离心DMSO处理测定冷冻细胞解冻细胞调整细胞浓度MTT处理孵化离心DMSO处理测定实验要

12、求：掌握冷冻细胞的活性测定的基本方法，熟悉常用试剂和常用的液体配制方法，掌握酶标仪的使用以及设定对照。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13程序冷冻仪14CO 2培养箱25倒置显微镜3一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48酶标仪1进口，连续波长9离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头10双目显微镜258、培养细胞的染色体标本制备与分带技术实验内容：8.1培养细胞的染色体标本制备对数期细胞秋水仙素处理收集细胞低渗处理固定滴片染色镜检结果分析8.2G带技术对数

13、期细胞秋水仙素处理收集细胞低渗处理固定滴片胰蛋白酶-EDTA处理甲醇处理染色镜检结果分析8.3不同传代数细胞染色体的检验不同传代数细胞秋水仙素处理收集细胞低渗处理固定滴片胰蛋白酶-EDTA处理甲醇处理染色镜检结果分析实验要求：掌握培养细胞的染色体标本制备和G带技术，了解动物染色体的数目和特点。检查传代细胞染色体的变化应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱22高压灭菌锅13显微镜254CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6超净工作台47离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头9、小鼠的免疫试验和饲养

14、层细胞的制备实验内容：9.1、腹腔免疫9.2、皮下免疫9.3、细胞饲养层免疫激活小鼠解剖小鼠取腹腔液离心接种细胞培养细胞实验要求：掌握免疫常用方法，并设计免疫程序掌握；制备用于杂交细胞的饲养层，为制备杂交瘤细胞做准备，深化对饲养层作用的理解。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13显微镜254CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱310、骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的制备实验内容：10.1骨髓瘤细胞的解冻离心接种10.2免疫脾细胞的制备免疫小鼠解剖取脾脏获取脾脏细胞过滤细胞离心实验

15、要求：保证解冻细胞成活率>70，保证单细胞率>90，细胞融合处理后不要有过大的细胞团快。掌握杂交瘤细胞的基本方法。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13显微镜254CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱39离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头11、细胞融合实验内容：11.1细胞的解冻离心接种11.2免疫脾细胞的制备免疫小鼠解剖取脾脏获取脾脏细胞过滤细胞离心11.3细胞的融合调整细胞浓度融合细胞（PEG融合）

16、离心接种换液实验要求：保证解冻细胞成活率>70，保证单细胞率>90，细胞融合处理后不要有过大的细胞团快。掌握杂交瘤细胞的基本方法。应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13显微镜254CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱39离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头12杂交瘤细胞选择和克隆化培养实验内容：12.1HAT筛选12.2HT筛选12.3克隆培养（有限稀释法）12.4融合细胞检测（以下方法可选） A 增长法

17、 B 标记法（荧光标记）实验要求：掌握杂交瘤细胞选择的基本方法掌握克隆培养（有限稀释法）掌握融合细胞检测的基本方法应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13显微镜254CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱39离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头13血清制备或抗血清制备和抗体的检测试验实验内容：13.1取血血清析出血清分离血清稀释血清冷冻13.2普通血清的灭活13.3抗原包被抗原洗涤孵化一抗洗涤二抗洗涤酶标物洗涤酶底物检测

18、实验要求：掌握血清制备的方法掌握血清灭活的方法学习ELISA法的基本技术，了解影响其效果的关键因素应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13显微镜254CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱39离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头14单克隆抗体的制备与分离纯化实验内容：14.1单克隆抗体的制备杂交瘤细胞培养收集上清液14.2单克隆抗体的分离纯化A 硫酸铵法 抗体样品稀释硫酸铵沉淀离心重复以上步骤提取或球蛋白透析处理（水透析

19、，PBS透析）冷冻保存B DAE52离子交换柱的装柱平衡柱样品上柱连续洗脱检测蛋白收集蛋白透析处理（水透析，PBS透析）冷冻保存实验要求：设计不同方法制备,分离单克隆抗体应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅13酶标仪1连续波长4CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱39离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头10蛋白检测仪111梯度混和器115小鼠超数排卵技术和胚胎移植实验内容：小鼠PMSG,HCG,FSH,LH的超数排卵，

20、冲卵（或胚胎）捡卵（或胚胎）小鼠的手术法胚胎移植胚胎的质量检查实验要求：掌握小鼠PMSG,HCG,FSH,LH的超数排卵技术，掌握冲卵（或胚胎）技术掌握捡卵（或胚胎）技术掌握小鼠的手术法胚胎移植掌握胚胎的质量检查的标准应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33解剖显微镜64CO 2培养箱25倒置显微镜1一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱216小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养及胚胎干细胞滋养层的制备实验内容：16.1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养小鼠配种小鼠解剖取胚冲洗剪碎过滤离心接种换液16.2小

21、鼠胚胎干细胞滋养层的制备丝裂霉素C处理成纤维细胞洗涤消化调整浓度接种实验要求：掌握小鼠胎成纤维细胞（MEF）的原代培养方法掌握小鼠胚胎干细胞滋养层的制备方法分析影响小鼠胚胎干细胞滋养层的因素应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33解剖立体显微镜64CO 2培养箱25倒置显微镜3一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱29离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头17小鼠胚胎干细胞（ES）的体外培养实验内容：小鼠超数排卵小鼠冲胚小鼠干细胞饲养层制备小鼠胚胎干细

22、胞（ES）的体外培养实验要求：小鼠超数排卵小鼠充胚小鼠干细胞饲养层制备小鼠胚胎干细胞（ES）的原代培养小鼠胚胎干细胞（ES）传代培养掌握实验设计应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33针头滤器1204CO 2培养箱55倒置显微镜3一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱29离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头18植物组织与细胞培养基的配制实验内容：18.1MS培养基贮备液配制18.2MS培养基配制18.3培养基高压蒸汽灭菌实验要求：掌握MS培养基配制掌

23、握MS培养基灭菌应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33针头滤器1203电子分析天平44天平419外植体的消毒与愈伤组织诱导实验内容：19.1外植体的消毒19.2外植体的取材培养与愈伤组织诱导实验要求：掌握外植体的取材、灭菌、培养与愈伤组织诱导应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1超净工作台420植物悬浮细胞系的建立实验内容：悬浮细胞的取材悬浮细胞的制备悬浮细胞的原代培养悬浮细胞的传代培养实验要求：掌握植物悬浮细胞的取材掌握植物悬浮细胞的制备掌握植物悬浮细胞的原代培养掌握植物悬浮细胞的传代培养掌握实验设计应配备的主要设备名称和台

24、件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33针头滤器1204冰箱15恒温光照旋转摇床221原生质体的分离与培养实验内容：原生质体的取材原生质体原代培养原生质体观察实验要求：掌握原生质体的取材掌握原生质体的培养掌握实验设计应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1光照培养箱32高压灭菌锅33超净工作台422流式细胞术分选血细胞试验实验内容：细胞诱导细胞采集细胞处理细胞电泳分析流式细胞仪分析实验要求：掌握细胞采集方法掌握细胞处理方法掌握细胞分析的关键步骤掌握细胞分选的关键步骤分析结果的影响因素了解仪器的主要结构，用途和熟练基本使用方法应配备的主要设备名称和台件数序

25、号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33针头滤器1204CO 2培养箱25倒置显微镜3一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱29离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头10流式细胞仪1进口（包括分析和分选）11电泳仪323细胞凋亡的诱导及生化检测实验内容：细胞诱导细胞采集细胞处理细胞电泳分析流式细胞仪分析结果分析实验要求：掌握细胞采集方法掌握细胞处理方法掌握细胞分析的关键步骤掌握细胞分选的关键步骤分析结果的影响因素了解仪器的主要结构，用途和熟练基本使用方法应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称每组应配台件数备注1干燥箱32高压灭菌锅33针头滤器1204CO 2培养箱25倒置显微镜3一台进口，配自动摄像装置6荧光显微镜1一台进口，配自动摄像装置7超净工作台48水浴箱29离心机22台高速离心机（>2000转/分钟），10ml转头，1.5ml转头，培养板转头10流式细胞仪1进口（包括分析和分选）11电泳仪324动物细胞大规模培养技术实验内容：细胞采集细胞处理细胞分析物质检测结果分析实验要求：掌握细胞采集掌握细胞处理掌握细胞分析掌握物质检测的方法掌握结果分析掌握实验设计了解仪器的主要结构，用途和熟练基本使用方法应配备的主要设备名称和台件数序号设备名称