实验SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

1、实验8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量Mr原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中， 蛋白质的迁移率取决于它所带净电荷及分子的大小和 形状。在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）和还原剂（如巯基乙醇）处理蛋白质样品，则蛋白质分子中的二硫键被还原，1g蛋白质可定量结合 1.4g SDS。由于SDS呈解离状态，使蛋白质亚基带上大量的负电荷，其 数值大大超过蛋白质分子原有的电荷量， 因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 各 种蛋白质 -SDS 复合物表现出相等的电荷密度，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳时，它们纯粹按

2、照 分子的大小由凝胶的分子筛效应来进行分离， 有效迁移率与相对分子量的对数成很好的线性 关系。用这种方法测定蛋白质的 Mr,简便、快速，只需要廉价的设备和卩g量的蛋白质样品。所得的结果，在Mr范围内，与用其他方法测得的 Mr相比，误差一般在 ± 10%以内。因此SDS测定Mr的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。现在经SDS-聚丙烯酰胺凝胶研究过的蛋白质已经有很多种了。实验证明,在蛋白质溶液中加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS复合物。在一定的条件下, S

3、DS 与大多数蛋白质的结合比为 1.4gSDS/1g 蛋白质。由于十二烷基 硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质的Mr时，应注意以下几个问题：1. 如果蛋白质 -SDS 复合物不能达到 1.4gSDS/1g 蛋白质的比率并具有相同的构象,就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下 3个：二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去,并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作为还原

4、剂。在有些情况下,还 需要进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。溶液中的SDS浓度：溶液中SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需达10倍以上。溶液的离子强度：溶液的离子强度应很低，最高不能超过0.26，因为SDS在溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度, 在低离子强度的溶液中, SDS 具有较高的平衡浓度。2. 不同的凝胶浓度适用于不同的Mr 范围, Weber 的实验指出,在 5%的凝胶中,Mr25000200000 的蛋白质,其 Mr 的对数与迁移率呈直线关系；在 10%的

5、凝胶中, 1000070000Mr 蛋白质呈直线关系；在 15%的凝胶中, 1000050000Mr 的蛋白质呈直线 关系； 3.33%（以上各种浓度的凝胶, 其交联度都是 2.6%）的凝胶可用于 Mr 更高的蛋白 质。可根据所测 Mr 范围选择最合适凝胶浓度, 并尽量 Mr 范围和性质与待测样品相近的 蛋白质做标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移 距离即为相对迁移率）最好在 0.20.8 之间均匀分布。在凝胶电泳中,影响迁移率的因素较多,而在制胶和电泳过程中,很难每次都将各 项条件控制的完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定 Mr，每次测定样品必须同时做标准

6、曲线,而不得利用另一次电泳的标准曲线。3. 有许多蛋白质，由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如a -胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在 SDS 与巯基乙醇的作用下,解离成亚基或单条肽链。因此,对于这一类蛋白质,SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的Mr而不是完整分子的 Mr。为了得到更全面的资料，还必须用其他方法测定其Mr及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果相对照。4. 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其 Mr，已发现有些蛋白质用这种方法测出的 Mr 是不可靠的 .这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原

7、蛋白等。例如组蛋白Fi，它本身带有大量的正电荷，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，她Mr是21000，但SDS礙胶电泳测得的结果却是 35000。因此在分析SDS-凝胶电泳所测得的 结果时，应该小心。一般至少用两种方法来测定未知样品的Mr，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定 Mr，也可使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交 联度相同）的SDS凝胶中电泳，得到 Ferguson图。如果待测样品的自由迁移率m°与标准蛋白质的mo基本交于一点，而且在不同浓度的 SDS-凝胶中测得的 Mr都相同，则表明 此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正

8、常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其 Mr。现在常用做SDS-凝胶电泳的缓冲系统有好几种，有连续系统的也有不连续系统的。 操作方法一 贮液及凝胶溶液的配置方法，参照聚丙烯酰胺凝胶电泳中的贮液配制方法，只是在分离胶和浓缩胶液中加入 SDS，使SDS的浓度达到0.4%，电极缓冲液中SDS浓度达到1mg./ml, 样品缓冲液中的 SDS浓度为2g/100ml.SDS-凝胶电泳可采用垂直柱型，也可采用垂直板型。由于垂直板型电泳操作方便，样 品泳动的起点一致，便于对样品的分离情况做比较，目前大多采用此型。二 样品的制备一般是将样品溶解在含 1%SDS、1%巯基乙醇的0.01mol/L,pH7.2的磷酸缓

9、冲液中，在 100C加热25分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.051mg/ml。也可以将上述溶液在 37C保温2小时而不是100C加热。一般说来，两种处理的结果都 一样。但如果蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37C保温处理就会引起样品的水解，使测定失败，而100 C加热3分钟一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情 况，需采用特殊的样品处理方法。1. 标准蛋白样品的制备称取细胞色素c、胰凝乳蛋白酶原 A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0.2mg左右，分别放入小试管中，按 0.5mg/ml 溶液的比例，向样品中加入“样品溶解液” （见 试剂的配制） ，使充分溶解，轻轻盖上软木塞（

10、不要盖紧，以免加热时迸出），将小试管放入沸水浴中加热 3 分钟，取出冷至室温。2. 待测蛋白质样品的制备固体样品的制备与标准蛋白质相同。 如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液” （各种溶质的浓度均比“样品溶 解液”高 1 倍，将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。若待测溶液 太稀可事先浓缩：若溶液的含盐量太高，则需先行透析。处理好的样品即可用于电泳。每个凝胶样品孔内加5卩g蛋白质（或更少）便可得到清晰的区带。处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长的时间，使用前在100C水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。三 电泳将聚合好的凝胶连同制胶模具装置在电泳槽上，拔掉样品槽

11、模板（梳子），用电泳缓冲液清洗样品孔，然后将上下电极槽注满缓冲液，检查上槽无泄露，即可加样。用微量注射器按号向凝胶样品孔中加样，没孔加 20卩l （含蛋白质15卩g）,稀的样品可适量增加其体积。加样完毕后，打开直流稳压电源（负极接上槽，正极接下槽，事先接好），将电流调至5080mA （根据凝胶板的横截面积适当调节增减），保持电流强度不变，待染料（染料已事先加在“样品溶解液“中）迁至距凝胶下端约1cm处，停止电泳。四染色、脱色将凝胶取出，滑入一白瓷盘或大培养皿中，在染料区的中心插入细铜丝做为标志，加入染色液，染色1小时左右。倾出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换液一次，直至背景清晰

12、。五Mr的计算通常以相对迁移率mR来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离见图3,按下式计算：相对迁移率mR=样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）以标准蛋白质 Mr的对数对相对迁移率做图，得到标准曲线如图4所示，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。图3、4试剂和器材试剂1.标准蛋白质（纯品）标准蛋白质来源Mr细胞色素c马心12500胰凝乳蛋白酶原牛胰25000胃蛋白酶猪胃35000卵清蛋白鸡卵43000牛血清清蛋白牛血清670002. 0.2mol/l,pH7.2磷酸盐缓冲液：取280ml 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液， 加

13、入720ml0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液，混匀后调pH至7.2。此溶液用来进一步配置凝胶缓冲液、电极缓冲液和样品溶解液。3. 样品溶解液：0.01mol/ L,pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02% 溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法如下：SDS100mg巯基乙醇0.1ml甘油1ml溴酚蓝2mg试剂 20.5ml加蒸馏水至总体积10ml4.电极缓冲液： 0.1%SDS，0.1mol/L,pH7.2 磷酸盐缓冲液（或 Tris-HCl 缓冲液）：取 1g SDS， 加入 500ml 试剂 2，用蒸馏水定容到 1000ml.5染色液：0.

14、25g考马斯亮蓝 R250,加入454ml 50%甲醇和46ml冰乙酸。6.脱色液： 75ml 冰乙酸， 875ml 蒸馏水与 50ml 甲醇混合。7.SDS:市售化学纯 SDS需要结晶后使用。重结晶的方法如下：称取20gSDS,放入50ml圆底烧瓶中，加约半牛角匙活性炭及 300ml 无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝 管。在水浴上加热到乙醇微沸，回流约 10 分钟，用热过滤漏斗趁热过滤。滤液应是无色透 明。滤液冷至室温后，移至一 20C冰箱中过夜。次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量一20C无水乙醇洗沉淀 3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40C以下烘箱烘干。简明操作方法1将

15、成套的两块玻璃板正确防如硅胶条中，然后夹在电泳槽中，按对角线顺序旋紧螺丝， 注意用力均衡以免夹碎玻璃。安装好电泳槽后，用1 5 %琼脂封底，待琼脂凝固后即可制胶。2将已经配制好的分离胶液轻轻混匀后，灌入玻板胶腔中至适当高度，表面加一薄层蒸馏水或双蒸水封闭胶液表面。 开始加入水后， 会在凝胶液和水之间形成分界线， 在聚合过程中， 分界线会逐渐消逝，待分界面再次出现时，说明分离胶已经聚合完全。3待分离胶聚合后，倒掉表面的水，再将配制好的浓缩胶轻轻混匀后灌满玻璃板胶腔，迅速 插入样品梳，静置聚合。4待测样品用样品缓冲液制成0.51.0mg/ml左右的溶液，在沸水浴中加热34分钟，冷却后点样。5浓缩胶聚合后，拔掉样品梳，装好电泳槽，在上下槽中注入电极缓冲液，用微量注射器点 样，每个样品槽中点样 2040卩l。如果样品浓度太低，可以适当加大点样量。6上槽为负极，下槽为正极，连接好电泳仪电源，用恒压（100V）或恒流（30mA ）左右电泳，也可以在样品通过浓缩胶后，加大电压到 250V 进行电泳。当指示剂染料溴酚蓝到达 凝胶前沿还有 12cm 时停止电泳，倒掉电极缓冲液（上槽中的电极缓冲液还可重复利用，可以对它进行回收 ）,剥胶染色。7