甲基化特异性PCR(MSP)原理与引物设计说明

1、MSP原理其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,未甲基化的胞喀咤变成尿喀咤，而甲基化的胞喀咤不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核甘酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。引物设计原则标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfitesequencingPCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外，“MethPrime应用3'端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别，以及引物中最大允许的单核甘酸重复率。因为所有非甲基化的“C都被转换成“T”所以“M

2、ethPrimer中默认的重复“T为8个,而其他碱基重复数为5个。DNA的完全硫化是很重要的，因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C区域作为源序列，设计引物。对于BSP,引物设计的原则1:为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点:引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。对于MSP需要设计2对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则：为了最大限度的区分甲基化与非甲基化，引物的3

3、9;端至少包含1个CpG位点，我们可以自己设定CpG的“C"距3'末端的最远距离。"MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中至少有1个是CpG的“C"。引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。甲基化引物和非甲基化引物序列3'端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同的CpG位点退火，PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度，在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长，因为受Tm值限制，由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”，导致GC含量降低，从而引起Tm

4、降低。2套引物应有相近的Tm值，“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5C,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。问题解决参考引物设计步骤（以CLEC14A基因为例）：1.找到目标基因的启动子区（promoter）序列首先打开ensembl页面：./index.htmlBLAST/BLATbioMart|ToolsHelp&Dwume杭窥ion|EflogMirrorsSi«h|HumanV|for叵s_BRCA2or5:627973(3&3927朝9ororcocch值吁lie注nd榜如图在搜索框第一个物种选择Huma

5、n,基因填入要研究的基因名，点击GoOnJy tearching HunanCLEC14A3gllm3tdiCLEC14Avhsorestrict§dtoHuman*0/dL，廿me白存”CLEC“4入Hjriin口口门口；EN5GQOQO017&43143824103非25sB9-1G-typelectindomaincontaining14ASourceHGNCSymbol;Acc:l-K3NG:19S32C-7Y=ELECTINDOMAIN!FNMILY14,MEIMSHRACLECfMl6S4b.：UMgenerecorddesctiplion.C-TYPELECTI

6、NDOMAINFAMILY14,VIEhl日ERA4A.issriexiernalreferancematchedtcG&neENSG000001/M3SVariGnttaDle*PhanDtjpesLocation*EdennglRefs.*RggulafionDrihclagues*G曰net白搜索结果页面第一条下面箭头所指处Regulation,点击它（这里面主要是基因调控区域的信息）打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个promoter,长度在 2000bp 左右。ER二RM口F?7口笈Et:翱一口itV:iiiCTCB=W5心14MVqTH.WT726F13NStiD-

7、iE立1M淳口曲如T1的rniHEhiRufiLf皿¥CTCTDHdihjSrfed1j1JfJiSnflJJILBO驯g,ELdd即ELMUMflSZEfflErRi电uhr吗一PltJEOiF"J43I5SQ£z3KH!£i的睚:'hi*mEnisfiniHle审jgryTFhndipgst-eloifiSfifii3manaStigkJSuMlP日JSR3皿制奸EnihmbiR«gLibiary为讦日in中谏Sr|>叫。巧马施。1制h-FiB*fflEF期：JQm-dQR-i1由三三:一丁囱丁酒山¥-TF"

8、;mji?白被wS，g图BkuU虐ENSR1M0旗韩行利血加HP4fflOMi H；当匠E 1WBcgulaUiyDuidtf然后点击最右侧Show旁边的+,出现的就是启动子区的序列了AIMmQ<EIXuIu>：Z.；11:二kA二注二二二.二二二二二二二工二:二二二工工工ZifiW3TGBJyjfii£rJirriT3ffK&OLraSCffiZAj：GJ&Zcttcrtt二3nt:r:姐U.T7UJk>'j：.T13)2mjLL*GT3l£11.将序列信息复制，然后就可以进入下一步2. MSP引物设计./m

9、ethprimer/或者他们新开发的 2.0页打开MSP在线引物设计工具页面:面./methprimer2/进入后我们选择第一个就好SearchpredesignedprimersMap primers togenomesSequencemanipulationSequenceextractionMeihPnmeMgsdesignpfimersmrmostbfsunteccmersmbasediforprimers：and10predict.GpGJarvisonaninpu.sequencelitalwalwyoutosearchfcrpr«ledgr>

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11、rcdlpffimBirEfwproteiicodirqqirfieii.,IncRFJAs司EBRU与幅g,ESR1,NM00004mir-1-1RAN映j* CpGIslandprEugrrYoucanaiwus?(tieprogram：0眸&rtCpG13m力mmsequenceWTOCCTHCTGOCTTSCCTOGCWXiJZKCTaDQCWH 双 0X6WIK«nX 咙 g其 SOOHMDHKCWCRCT口予也 CTCTXO7 TCCHSCS KPCTNR田IWXKFKCJtroKTCS TT KCTOZIK TTJU&HCl工 EWAlCCWOCiMHm

12、CQQUJlKHC口LTCqKCQCVEVKWSQEJaGGCGWSBffiEEa MGCGGKCiCGtXjLGCTCmCACCTQZlOaCClXtKGOCmrEOCCCCDCWGaZ ACOOK 时GMJUXJUCCCK1kx钮；OG£CG 匚MGGCMCknHKGCOCCM二 ECCH 口加二 C1C8 二 CTUHJLH Htor cowGdut TGitctMtaKt cTxcGAtoiwrtotrnkfcGCniATti% . rmftZgCTIXMTSCIXjKECrrGmZTEO其 mic EOSZKKMm B：TMgHM3GBKGGCUHCJU3HKiBKaDHC

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14、TTIC： :就就CUKM 期工解工但R 冷色JA2 口父Pick BiELtfite sequel ng PCR (BSPi pnmerEPick 驻eMigtil股B primersPick ohl MSP prime sW巾二用 仙，门：1 :.：7! -rpKkUHiy-fHinrr&进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击submit。CpGIslandPredictionNs用UM51M153ndi融n凰-MEGCpwcanlOEt却14m«a73550

15、.0O.flhldind251?77?120-3加。go疑EM3*21SJ915B05D000新生成的页面中会有CpG岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。将页面继续下拉即出现设计好的引物啦PrimerDesignResults我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意MSP需要两对引物，分别针对被甲Sewem金旨g一LflEEsi口in童温解4sMF1414.算No24200即a5S4mx。7545MP*MR1CTTMCCGAACCWWWCGAAA23543S;1丽29400ft5SS*80。-16Pradj匚IgizpPar组PairendCpGr-Canip_ry匚drrp_BndTmTm_drScore13041433B50010065.724133PnmerramgSeouence-13/L-n迎Eoj口eiEf叼r帕QQMSe*larwSelfendTinGC4扭由ilrkScoreg白TR3TTMQAA以