小鼠肿瘤模型

1、肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型， 另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。小鼠模型分三大类：第一类是以 S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后 第二天开始给药，给药 7 到 10 天，接种 10 天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。1. 关于构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用 PBS悬浮至13Xl06/mouse，接种即可，最好用 6号左右的针头，就是常用的 2ml 一次性注射的针头。2. 关

2、于腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约 89 天左右），可以传代，传代时取 1ml 注射器，用 2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点， 还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个就可以了，不用离心，直接用PBS36 倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不 好，需要注意调整，第二代以后，尽量 67 天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代 后可用于试验。3. 关于接种进行试验这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀

3、镊子剥开腹部皮 肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的 肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后， 接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计 数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候 喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的 接种，会使肿瘤与皮肤严

4、重粘连，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应 该在两者之间，进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取 一些。 O4. 关于观测指标主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第 6 天左右了，第 10 天 就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的办法， 剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围 经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破， 会严重影响瘤重。按照 S

5、FDA 的规定，平均瘤重小于 1g ，或者单个瘤重小于 200mg ，认为肿瘤生长不良， 试验作废。小鼠模型第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为C57。不产生腹水，只能皮下生长。 多用插块法或者匀浆法传代和接种做试验。有一种做法也是接种后第二天开始给药，还有一种做法是接种 三天后给药，接种后两周结束试验，剥取肿瘤称重。1. 关于瘤种构建体外细胞株，培养后 PBS悬浮至13X 106/site，接种至小鼠腋下，即可。2. 关于传代与接种剥取肿瘤，在 PBS 中取出肿瘤表面包膜和中心的坏死部分，剪刀剪成小块，小块大小以套管针的针 口为标准。用镊子将小块从针头处塞进 1820 号

6、的套管针，接种至小鼠腋下，用套管针中间的实体针将瘤还可以在上述肿瘤组织剪成小块后， 用玻璃匀浆器匀浆后， 200 目筛网过滤， 收集滤液， 活细胞计数， PBS 稀释后用注射器接种，稀释量也需要各个实验室自己摸索。也是三代后可用于试验。3. 关于观测指标可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重。小鼠模型第三类是以 P388 、L1210 为代表的白血病模型。宿主为 DBA2 ，也有人用 C57 与 DBA2 的 F1 代传代， DBA2 用于试验，但是我们两种宿主都传过代，没有发现有什么区别。他们能形成腹水，一 般不用于皮下接种试验，平时多用腹水传代，实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存

7、时间。也是接种 后第二天开始给药这个就不细说了，很多可以参考第一类，主要几点就是，他们的腹水都是血性的。另外，腹水量也不多， 有的时候可以先注射一到两毫升的 PBS 后，再抽取。肿瘤模型构建小鼠模型分三大类第一类是以S180 EAG H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用 KM可产生 腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下 接种构建模型， 接种后第二天开始给药 （这里与指导原则相悖， 指导原则要求肿 瘤长至 100-300 立方毫米时才给药），给药 7到10 天，接种 1 0天后结束试验， 剥取肿瘤称瘤重。1. 构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用 PBS悬浮至1

8、3X 106/mouse,接种即可，最好用 6号左右的针头，就是常用的 2ml 一次性注射的针头。细胞悬液接种时要选活力 好的细胞，就是对数期。细胞生长至瓶底 7080%满的时候认为是对数生长期。2. 腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约 89 天左右），可以传代，传代 时取 1ml 注射器，用 2ml 注射器的针头， 种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹 水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重 力，让腹水集中在某处便于抽取， 一般抽个就可以了， 不用离心， 直接用 PBS36 倍稀释后， 接种到新的老鼠腹腔， 腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的， 但

9、是血性腹水说明不好，需要注意调整。第二代以后，尽量 67 天的时 候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易 血性。三代后可用于试验。腹水瘤接种时，接种量不要太高，1*107/ml ，即可，多按 1：3 用生理盐水稀释，否则有可能腹水血性。超过 7 天的腹水再传代，动 物的周龄太大（ >6周）, 传代次数太多也很容易出现血性腹水。一般小鼠肿瘤模 型都控制在 30 多代以内（也有说 50 多代的）。出现血性以后可以调整一下：血 性腹水可以离心后加的NH4CL容液破红细胞，然后精确控制条件（接种量，传代 时间，动物周龄等） 传几代， 很多情况下再传一两代后会有无腹水血性的种鼠出 现，然后用这只种

10、鼠的腹水继续传代。腹水难抽有几种情况，要么接种天数不够，腹水不够多，一般要等动物肚子 很大了才去抽。要么就是压力的问题。 有的动物腹水很稠。 这时可撕开小鼠肚子， 拿掉针头，直接抽干净，最多的时候可抽到 5ml。3. 接种这个时候抽取的腹水需要量比较多， 有时需要处死种鼠后， 小心地用消毒眼 科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面 有倒勾的 镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口， 然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。 然后进过一定的稀释后， 接种 到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始 的时候可以适当

11、的计数， 但是要用台盼兰染色后计活细胞数 （计数的时候要注意， 有一些很细小的细胞是血细胞， 不要计数） 。如果接种细胞量偏大会造成肿瘤早 期就溃烂， 所以不要为了追求肿瘤生长速度而一味的提高接种细胞量。 接种部位 在小鼠腋下，但是不要深入到 腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。可以往尾 部或背部靠一些， 不要往腹部靠， 容易使肿瘤被垫料磨烂。 接种部位可以选择腋 下或者后肢 , 有的文章说是背部接种 ,但是背部血管不发达 , 营养不够 , 一般不建 议采用.接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有 的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往 里走，然后注射的时候感觉

12、 阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不 利于最后肿瘤的剥取。 也不要紧靠肌肉， 肿瘤会与肌肉严重粘连。 应该在两者之 间，接种的时候要精确控制接种在皮下，进针深度左右 , 针头沿皮肤水平进入 , 然后挑起表皮 , 注射。进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不 会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。防止接种的时候老鼠乱动，正确手法是用拇指和食指捏住老鼠的颈部皮肤， 无名指和手掌下部把老鼠的后肢捏住， 捏颈部的时候手指尽量多捏一点皮肤， 然 后右手（你是左手抓动物的话） 拉住后肢，尽量往下拉， 让老鼠的身体伸展开来， 在用无名指固定， 中指可以放在老鼠的身

13、体下面， 适当的往上顶， 使老鼠的腋下 一代完全平展， 皮肤不用绷得太紧， 平展就可以了， 另外接种的时候进针点很靠 下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前针头稍微动一动，能动就 说明在皮下，否则可能 在皮内或者肌肉内。一般来说都是有鼓包的但是要是你 接种位置太深入腋窝，你是看不到鼓包的。主要靠针头稍微动一动来判断。4. 观测指标主要是按时称体重， 试验结束后剥取肿瘤称瘤重。 因为出瘤已经是接种后 的第 6 天左右了，第 10 天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很 难剥，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些 帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验

14、结束。 肿瘤组织周围经常会有一些血窦 的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出， 正常的， 但是剥瘤子的时候不要把它 弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA勺规定，平均瘤重小于1g,或者单个瘤重 小 于200mg认为肿瘤生长不良，试验作废。第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为 C57。不产生腹水， 只能皮下生长。 多用插块法或者匀浆法传代和接种。 有一种做法也是接种后第二 天开始给药， 还有一种做法是接种三天后给药， 接种后两周结束试验， 剥取肿瘤 称重。1. 瘤种构建体外细胞株，培养后PBS悬浮至13X 106/site，接种至小鼠腋下，即可。2. 传代与接种体内瘤源用于传代接种

15、，有两种手段（均为无菌操作），套管针插块法对 瘤组织损伤小， 可能 100成瘤。 匀浆法对瘤组织损伤大， 成瘤可能小于 100。（1）插块法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于在PBS或% 无菌氯化钠注射液中洗涤干净， 然后剪开， 去处中心颜色变暗坏死部分， 以及外 表的包膜（如果比较明显的话），选外围发亮部分。清洗干净，然后换到干净的 PBS中，用剪刀剪成1mmft径左右的小块，最后用镊子将小块从针头处塞进1820 号的接种套管针（最好用的是胸膜活检针 20 号，但是现在已经买不到了，可以 用硬脊膜外穿刺针 18 号磨平针头后代替），在老鼠的皮肤上剪一小口，接种于 动物腋下或者其

16、他部位。 塞的组织块的量以接种针头的口径为准， 不能太紧也不 能太松，以孔径为标尺， 尽量保持差不多大小的接种量。 如出现出针挂组织的问 题，关键在于针头的磨制， 在针后部的小突起于小缺口吻合后， 实体针弯曲方向 应该与套管针磨制的斜面一致，接种时，实体针要推到底，也就是后 面的小突 起与小缺口契合， 然后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针， 还有就是瘤块一定要 完全塞入针头内，外面不能有漏出来的。（2）匀浆法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于PBS等体系中（以下均以PBS为例），用剪刀剪开，剔出中心的坏死部分，以及外表的包 膜（如果比较明显的话），清洗干净，然后换到干净的PBS中，

17、用剪刀剪成1mm直径左右的小块， 然后用玻璃匀浆器匀浆， 注意上下次数不可超过 5 次，匀浆时 可以适当的旋转， 200目筛网过滤，然后取滤液用台盼兰活细胞计数，根据计数 结果进行稀释， 最后将组织悬液用注射器接种。 最终的稀释量， 需要根据你瘤株 情况确定的接种量而定， 这个接种量经过一段时间的稳定后， 可以根据经验 （匀 浆液的浓度、粘度、肿瘤组织大小等情况）直接进行稀释，不需要计数，但是在 早期，还是建议进行计数后再稀释。 另外各种瘤株的情况不一样， 不光是接种量 不同，同样大小的瘤源匀浆后的活细胞数也会不同。比如NCI-H460匀浆后的活细胞数就比较多，而 A431 几乎没有活细胞。另外，如果一个瘤源不够，可以取 多个瘤源进行接种， 一般来说， 插块法， 一个瘤源接种 30 只动物是没有问题的， 匀浆法一般 2只也可以接种 30 只 了，为保险起见可以多预备一只瘤源。 注意考 虑可能需要剔出不合格瘤源的情况。最好不用带血清的培养液代替 PBS因为血清是异种蛋白，虽然裸鼠 T细胞 缺陷，但是B细胞和NK细胞完整，含血清的物质会引起裸鼠的免疫反应，连带 着接种的瘤组织也会被影响， 降低成瘤率和生长速度。 从成瘤效果来说， 无血清 培养基 >P BS>saline 。肿瘤模型体内传代的标准是，肿瘤体积大于 500mm以上就可以了，最好小 于 1000mm3接种的动