大豆异黄酮苷元检测方法的研究

1、大豆异黄酮苷元检测方法的研究                     作者：张磊,金桂芳,杨红,习志刚 【摘要】  目的 建立大豆异黄酮苷元含量测定方法。方法 采用HPLC法，Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm,5 m)，流动相：甲醇-0.3%磷酸溶液（体积比4852），流速0.7 mL/min，测定波长260 nm,柱温25 。结果 制备的大豆异黄酮苷

2、元总含量为70.98%;大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率分别为98.7%、98.9%和99.2%，RSD分别为2.1%、1.6%和1.4%。结论 所建立的测定方法重现性好、可靠，可用于3种大豆异黄酮苷元的含量测定。 【关键词】  大豆异黄酮苷元；高效液相色谱法；含量测定Abstract:Objective To establish an HPLC method for the content determination of isoflavone aglycones. Methods Isoflavone aglycones were analyzed on a  D

3、iamonsil C18 column (250 mm×4.6 mm，5 m). A mixture of MeOH-0.3%H3PO4（4852) was used as the mobile phase with a flow rate of 0.7 mL/min. The detecting wavelength was 260 nm at 25 .Results The content of  isoflavone aglycones in the sample was 70.98%.The average recoveries of genistein,daidz

4、ein and glycitein were 99.2%,98.7% and 98.9% with  RSD 1.4%,2.1% and 1.6%,respectively. Conclusions  This method can be used for the quality control of soy isoflavone aglycones.Key words:soy;isoflavone aglycones； HPLC大豆异黄酮有广泛的生理活性，具有抗氧化、防癌和抗癌、预防骨质疏松症、保护心血管系统和神经保护等作用。有资料表明，在哺乳动物体内，去除糖基配体后形成

5、的大豆黄酮苷元及其代谢产物均是弱雌激素样活性物质,苷元比糖苷更容易被人体吸收1,2。大豆异黄酮苷元广泛用于保健品、食品和化妆品等，正受到广泛的关注，因此建立一个稳定、准确的含量检测方法有重要的应用价值。1  仪器与材料      Dionex P680A高效液相色谱仪，数显恒温水浴锅（江苏省宏华仪器厂），旋转蒸发器(上海亚荣仪器厂)，SH2-D循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责公司）电子天平（Sartorius）。    染料木素、大豆苷元和黄豆黄素对照品 (购于上海同田生化技术有限公司,纯度均99%)，脱脂豆粕（

6、购于山西省曲沃县），AB-8大孔树脂（南开大学化工厂），聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；甲醇(色谱纯,英国TEDIA公司)，屈臣氏蒸馏水，其余试剂均为分析纯。2  方法与结果2.1  大豆异黄酮苷元的制备  取豆粕适量，用8倍量（g/mL）体积分数为70的乙醇溶液浸泡30 min，80  水浴回流提取2次，每次90 min；合并提取液，过滤后回收乙醇、浓缩；上AB-8大孔树脂,以体积分数为50的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩，45  烘干。适量乙醇溶液溶解，拌样上聚酰胺柱，以体积分数为70的乙醇溶液洗脱，得粗提浸膏，45 烘干。取一定

7、量的粗提物置于圆底烧瓶中，加入4倍量（g/mL）的7%盐酸-乙醇液，80  水浴水解2 h，浓缩，乙醚萃取，挥干乙醚；用适量体积分数为70的乙醇溶液溶解，石油醚脱脂，用200300目硅胶拌匀，自然干燥，上硅胶柱，用三氯甲烷-甲醇（体积比61）洗脱，收集洗脱液，挥去溶剂，得大豆异黄酮苷元混合物3,4。2.2  样品溶液的制备  精密称取大豆异黄酮苷元混合物28.50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取1.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0.0570  mg/mL的样品溶液。2.3  对照品溶液的制

8、备  分别精密称定大豆苷元、染料木素对照品13.20 mg、14.60 mg各置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，得浓度为0.264 0  mg/mL的大豆苷元及0.292 0  mg/mL的染料木素对照品溶液；精密称定黄豆黄素27.75 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，精密吸取1.0 mL，至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得0.111 0  mg/mL的黄豆黄素对照品溶液。4  储存备用。2.4  色谱条件56  Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 m)；

9、柱温25 ；流动相：甲醇-0.3%磷酸溶液（体积比4852）；流速=0.7 mL/min ；测定波长260 nm；进样量：20 L。  2.5  线性关系       分别精密吸取上述大豆苷元、染料木素、黄豆黄素对照品溶液0. 8、1.5、0.6 mL置100 mL量瓶中，甲醇定容，得混合对照品溶液。同法制备混合对照品溶液-，浓度见表1，混合对照品HPLC色谱图见图1。表1  混合对照品溶液中大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的质量浓度 （略）Tab.1  Contents of genis

10、tein,daidzein and glycitein in the control sample/按上述色谱条件依法测定，分别以大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的浓度(g/mL)对峰面积作回归计算,得回归方程（n6）分别为：    y=5836.1x+0.8812，r=0.9994；    y=1177.4x+0.1372，r=0.9994；    y=3256.6x+0.894，r=0.9992。    大豆苷元、黄豆黄素和染料木素分别在2.11221.12 g/ mL，0.

11、666 06.66 0 g/mL,4.38043.80 g/mL范围内，线性关系良好。1.大豆苷元  2.黄豆黄素  3.染料木素图1  对照品HPLC色谱图（略）Fig.1  HPLC chromatogram of reference substance2.6  精密度试验       取对照品溶液，重复进样6次，记录色谱图，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为0.5%、 0.6%和0.8%。2.7  重复性试验  取同一批次

12、大豆异黄酮苷元混合物6份，按“2.2”项下，制备样品溶液，测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为2.0%，1.2%和1.4%。     2.8  稳定性试验       取同一样品溶液分别在0、2、4、6、8、12 h于上述色谱条件下测定峰面积值，计算RSD值，得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的RSD分别为0.70%、1.4%  和0.74%。2.9  回收率试验  取大豆异黄酮苷元混合物6份，精密称定，分别准确加入3种对照

13、品溶液各适量，余同“2.2”项下操作。分别计算得大豆苷元、黄豆黄素和染料木素平均回收率，结果见表2、表3、表4,结果表明，3种苷元回收率均符合要求。2.10  大豆异黄酮苷元含量测定  精密吸取样品溶液（0.171 mg/mL），测定3次，结果见表3,样品中种苷元总质量分数为70.98%,样品HPLC图见图2。表2  大豆苷元加样回收率实验结果（略）Tab.2  Recovery results of daidzein（n6）表3  黄豆黄素加样回收率实验结果（略）Tab.3  Recovery results of glycitei

14、n（n6）表4  染料木素加样回收率实验结果（略）Tab.4  Recovery results of genistein（n6）表5  样品含量测定结果（略）Tab.5  Results of sample determination（n3）1.大豆苷元  2.黄豆黄素  3.染料木素图2  样品HPLC色谱图（略）        Fig.2  HPLC chromatogram of the sample3  讨 论

15、60;       大豆中异黄酮存在的形式主要是结合型的糖苷,其含量占大豆中异黄酮含量的95%以上,虽然游离的苷元含量不足5%,但它们表现出来的活性要比结合型的糖苷高得多。在用水解法制备大豆异黄酮苷元时，常用酶、碱和酸法水解。酶水解条件要求高、成本高，碱性条件水解得到异黄酮苷元不稳定，容易降解，本试验用酸水解，而常用强酸中,硫酸、硝酸有氧化性，可能破坏异黄酮苷元上的酚羟基，所以本试验选用盐酸。        本实验分别考察了不同体积比的甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸，乙腈-水作为流动相，结果显示甲醇-磷酸，且流速为0.7 mL/min时,可使大豆苷元、黄豆黄素和染料木素3种苷元达到基线分离，也可使大豆苷、染料木苷和上述3种苷元共5种成分达到基线分离；豆粕提取物中有油脂，样品用石油醚脱脂后，测定干扰少，效果理想。     本文采用高效液相色谱法同时测定3种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮苷元产品的生产制备及推广应用提供了支持。参考文献】  1 张逊，姚文，朱伟云.肠道大豆异黄酮降解菌研究进展J.世界华人消化杂志，2006，14（10）：973-978.2 虞丹.植物雌激素大豆异