多环芳烃降解菌的筛选及其对芘的降解研究-

1、第1期多环芳烃降解菌的筛选及其对芘的降解研究王蕾,聂麦茜,王志盈,玉亚,徐会宁,张睿(西安建筑科技大学环境与市政工程学院,陕西西安710055摘要:以焦化厂排水沟底泥为菌源驯化筛选出6株多环芳烃降解菌。实验结果表明:各菌对芘均有一定的降解能力,不同菌体表面疏水性不同,这种不同可以影响到反应初期菌株对芘的表观降解率,菌体的疏水性表面较亲水性表面对芘有更强的吸附性;保存的一组天然混合菌对芘降解率较低,没有表现出优于单个菌株的协同作用;多环芳烃降解菌在芘培养液中生长快慢和降解能力没有必然联系。对两株菌体表面疏水性相差较大的菌株在不同条件下的芘降解性能研究结果表明:2#菌降解芘的最佳温度是30,9#菌

2、降解芘的最佳温度是40;Mn 2+对2#降解芘有促进作用,对9#菌几乎无影响,Cu 2+对各菌芘降解均有不同程度的抑制作用;外加葡萄糖对于2#菌和9#菌的芘降解有促进作用。关键词:芘;优势菌;降解;疏水性;温度;无机离子;外加碳源中图分类号:X132文献标志码:A文章编号:1003-6504(201001-0043-05Screening of PAH-degrading Strains and Study on MetabolicProperties of PyreneWANG Lei ,NIE Mai-qian ,WANG Zhi-ying ,YU Ya ,XU Hui-ning ,ZHA

3、NG Rui(School of Environment and Municipal Engineering ,Xi an University of Architecture and Technology ,Xi an710055,China Abstract :Six strains and a group of original mixed strains were isolated and screened from the bottom sludge of coke-plant wastewater.Results indicated that most of the bacteri

4、a had the best pyrene-degrading capabilities.Six strains had the different cell surface hydrophobicity ,and the difference of cell surface properties could affect the pyrene removal rate in early reaction period.Results also showed that pyrene was more likely to be adsorbed onto cell surface with hy

5、drophobicity than onto cell surface with hydrophobicity.The original mixed strains had the relatively low pyrene biodegradation rate ,and showed no synergistic effect among different strains.The strain growth in pyrene cultural medium had no necessary connection with its pyrene biodegradation capabi

6、lity.Two strains with different cell surface properties were chosen to study the individual factors affecting pyrene biodegradation.Results showed that the optimum temperature to pyrene biodegradation was 30for strain 2#and 40for strain 9#.Mn 2+could promote the pyrene degradation velocity of strain

7、 2#while it was almost no effect on strain 9#,Cu 2+had an inhibitory effect on pyrene biodegradation of the two strains.Exotic carbon source test showed that glucose was a beneficial substrate on the degradation of pyrene for both strain 2#and strain 9#.Key words :pyrene ;predominant strains ;biodeg

8、radation ;cell surface hydrophobicity ;temperature ;inorganic ions ;exotic carbon source多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons ,简称PAHs 是一大类广泛存在于环境中的有机污染物,也是最早被发现和研究的化学致癌物1。多环芳烃在环境中污染面广而分散,不易集中治理,一些环境微生物经过适应性驯化和诱导,可以对PAHs 进行代谢分解,甚至矿化2-4。已有研究表明,微生物修复(降解是环境中多环芳烃去除的最主要途径5。多环芳烃降解菌的筛选一直是国内外生物降解的一个重要方面。迄今已分

9、离到多种降解菌,但多以降解萘、菲等低分子量PAHs 为主。近年来,进一步筛选四环或四环以上的高分子量PAHs 高效降解菌成为多环芳烃修复工作的必然趋势。而芘作为高分子量PAHs 的典型代表,常被作为监测PAHs 污染的指示物和其他PAHs 光化学降解、生物降解的模型分子6。因此本实验以焦化废水排水沟底泥为优良菌源,通过驯化分离筛选出多环芳烃优势降解菌并对其对芘的降解性能进行了收稿日期:2008-09-18;修回2008-12-05基金项目:陕西省教育厅自然专项项目(07JK290作者简介:王蕾(1983-,女,博士研究生,研究方向为难降解有机物的微生物处理技术,(手机159*(电子信箱yimi

10、003 。Environmental Science &Technology第33卷第1期2010年1月Jan.2010第33卷 初步研究,以期为实际微生物修复多环芳烃污染环境奠定基础。1实验材料与方法1.1试验材料菌源:焦化废水毒性大,含多种多环芳烃及杂环芳烃,本研究以陕西富平焦化厂焦化废水排水沟底泥为优良菌源,其外观为半流体,呈黑褐色。驯化实验用土壤:西安建筑科技大学小西门内东侧花园土。晾干,粗筛(除去树枝,碎玻璃等杂物,过1mm ×1mm 筛,备用。1.2主要培养基和试剂5.0g/L 芘丙酮标准溶液:准确称量0.2500g 芘标准试剂,用丙酮溶解于50mL 棕色容量瓶中

11、并定容,摇匀使芘浓度为5.0g/L 。牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3g ,蛋白胨10g ,NaCl 5g ,蒸馏水1000mL ,pH7.27.4。121高压蒸汽灭菌30min 备用。无机盐培养基:磷酸盐缓冲液:K 2HPO 4·H 2O 21.75g ,Na 2HPO 4·12H 2O 33.4g ,KH 2PO 448.7g ,NH 4Cl 5.0g ,蒸馏水1000mL ;MgSO 4溶液:MgSO 422.5g ,蒸馏水1000mL ;FeCl 3溶液:FeCl 30.25g ,蒸馏水1000mL ;微量元素溶液:MnSO 439.9mg ,ZnSO 4·

12、;H 2O 42.8mg ,(NH 4MoO 24·4H 2O 34.7mg ,蒸馏水1000mL 。取上述磷酸盐缓冲液5.0mL ,MgSO 4溶液3.0mL ,CaCl 2溶液1.0mL ,FeCl 3溶液1.0mL ,微量元素溶液1.0mL ,定溶至1000mL 。经高压蒸汽灭菌,备用。分离纯化培养基:在无机盐培养基中加入2%的琼脂,湿热灭菌后,在无菌操作下加入多环芳烃碳源混合物,摇匀。然后在灭好菌的培养皿中倒成平板备用或分装于提前灭菌的带塞试管中制成斜面备用。1.3试验方法取来含优良菌源的污泥后,用均匀处理器处理20min 使污泥分散均匀,充分曝气活化24h 。称取土壤1kg

13、 放入自制土壤反应器中,加入蒽菲芘各25mg 、葡萄糖1g 、Mn 2+5mg 后搅匀,再加入活化后的优良菌源,加水搅拌使土壤达一定湿度(目测土壤均匀,松散,潮湿,把反应器放入学校花房温室(使之通风、可接受阳光又免受雨淋,以后每天浇水、搅拌。驯化周期为三个月。称取10g 驯化后的新鲜土样于250mL 三角瓶中,在无菌操作条件下,加入90mL 无菌水,浸泡振摇20min 。上清液用无菌水稀释,分别取107、108、109三个倍数的稀释液各0.2mL 于盛有分离培养基的平板中央,用玻璃刮刀均匀涂布,37恒温培养箱中培养2d ,挑取长势较好的单一菌落划线分离,反复划线分离,直至获得纯菌株。根据初步筛

14、选出的优良菌对芘的降解情况进一步优选多环芳烃降解菌。无菌条件下,从斜面上挑取一环菌,接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中,细胞表面疏水性采用BATH 测定方法7,具体为取一定量调整浓度(OD 600=0.5300.540的菌悬液4mL 于圆底具塞玻璃管中,按梯度加入二甲苯,对照组不加二甲苯。室温下剧烈振荡60s ,静置5min 分层。用无菌注射针头快速吸取下相水溶液3.0mL ,以磷酸盐缓冲液为对照,在600nm 波长下测定A 值,每个实验重复三次。细菌细胞表面疏水率(CSH %按下式计算:优良菌对芘的降解过程用MPN 法测定菌体的生长情况,具体为将水样做倍比稀释,至适宜的稀释度为止,应使低稀释度的各

15、管都长菌,而以高稀释度的各管不长菌为宜。每个稀释度重复接种至少3管。37恒温培养箱中培养2d ,检查结果确定数量指标8,绘制生长曲线。取下反应瓶,把水样用环己烷在125mL 梨形分液漏斗中反复萃取三次,萃取上清液合并于10mL 比色管定容。然后,取0.2mL 在另一比色管中稀释到10mL ;在波长为242nm 处用紫外分光光度法测其吸光度,根据标准曲线换算成浓度。回归直线方程为:y =2.2982x -0.009,R 2=0.9996。芘降解率为:芘降解率=(芘初始加入浓度-芘剩余浓度/芘初始加入浓度×100%(244第1期2试验结果与分析2.1优良菌株的筛选结果经平板划线分离纯化后

16、,共得到30余株多环芳烃降解菌。在筛选的过程中,根据各菌种在筛选培养基上生长出来的时间及菌落的长势,从30余株中挑选9余株生长时间快菌落典型的菌种保存。根据其在驯化筛选培养基上生长快慢,长势好坏,以及菌落的典型性,综合考虑选取1#,2#,4#,5#,7#,9#,并保留一组天然混合菌做进一步优选实验。细菌的细胞表面疏水性是决定细菌非特异性黏附到各种生物和非生物表面及界面的最重要的因素之一,也是影响细菌吸收和降解疏水性有机物质的主要因素之一7,因此研究细菌的细胞表面疏水性具有一定意义。实验首先测定了利用牛肉膏蛋白胨培养基培养出的细菌的菌体表面疏水性,其结果如图1所示。从图1中可以看出4#菌的疏水性

17、最大为65.5%, 2#菌疏水性次之为50.0%,9#菌的最小为10.2%,1#菌、5#菌、7#菌的疏水性居中,在20%40%范围内。细菌表面物质成分相当复杂,但只有含有疏水侧链或疏水端的成分才决定细菌的表面疏水性。细胞壁和膜中的疏水性脂质物质、亲水性低聚糖、不断重复的糖蛋白使得脂多糖分子具有两亲性特点,菌体表面的憎水性说明细胞与憎水性的物质有较强的相容性。菌体表面性质的不同可能影响到细胞摄取多环芳烃的方式,进而影响到多环芳烃分子的生物降解过程。分别在不同时刻取下反应体系萃取测值,实验结果如图2所示。从图2中可以看出随反应时间的延续,各菌对芘均呈现一定的降解能力(空白对照曲线一直很低,且降解率

18、趋势总的来说是不断升高的。在给定反应时间初期2d时,2#菌和4#菌降解率曲线斜率最大,降解最快,此后2#菌降解率稍有回落,之后稳固上升,降解速率最快;4#菌降解率回落后降解率曲线保持平缓。9#菌降解曲线波动很大,在12d稳固增加,26d曲线稍有回落,接着呈上升趋势,到第10天大幅度回落,但总的趋势也是不断上升的。从第13天的降解率结果看,2#菌降解最快,其次是5#菌和9#菌。有文献报道7菌体表面疏水性有可能导致菌体表面对多环芳烃这类疏水性物质的吸附,4#菌疏水性最大,反应初期芘的表观降解率大很可能与菌体表面疏水性大导致芘在菌体表面的吸附结合有关,而不是真正的降解。从图2还可以看出天然混合菌的降

19、解并不快,没有显示出各菌之间的协同优势,说明获得的天然混合菌并一定是降解多环芳烃的优势组合菌。王蕾,等 多环芳烃降解菌的筛选及其对芘的降解研究第33卷 菌种在培养基中的生长周期不同,这是由于各菌种本身的差异,对生长环境的适应能力,以及自身的繁殖能力等。从生长曲线结果看10d 前,4#菌生长最好,其次是2#菌,10d 后开始进入衰减期,5#菌后期生长较快在第10天达到其生长量最大值,超过2#菌和4#菌。其他各菌生长曲线变化平缓。 从图2和图3可以看出在初始芘浓度为50mg/L 的体系中,2#菌生长的好也降解的快,5#菌在10d 时生长旺盛,降解率也有增快的趋势。而4#菌生长良好降解率却不高,这说

20、明并不是所有生长好的菌,降解率都高。生长能力和降解能力没有必然联系。根据实验结果,选取降解效率好,并且具有表面性质有代表性的2#、9#菌为对象做本论文下面的实验。2.2温度对优良菌降解芘的影响分别放入20、25、30、35、40,160r/min 恒温摇床振摇。在48h 时取下测定反应体系中剩余芘浓度,计算降解率,以确定温度对优良菌降解芘的影响。试验结果见图4,从图4可以看出,温度对2#菌和9#菌对芘的降解有一定的影响。对于2#菌在30时,对芘降解率最高,48h 降解率达23.57%,小于或大于这个温度降解率均变低;对于9#菌情况正好相反,30时降解率最小,温度增大或变小芘降解率都增加。40的

21、降解率相对最高为28.26%。其原因有待进一步研究。 2.3无机离子对优良菌降解芘的影响本节试验研究Mn 2+、Zn 2+、Co 2+、Mo 6+、Fe 3+、Cu 2+各离子对2株优良菌对芘降解的影响,于2#菌Mn 2+和Mo 6+对降解有促进作用,且前者优于后者,降解率可以分别提高4%和2%;Co 2+、Fe 3+、Cu 2+均有不同程度的抑制作用,其中Cu 2+最为明显;Zn 2+对2#菌的降解没有影响。对于9#菌各离子对降解没有明显的促进作用,其中Mn 2+、Co 2+、Cu 2+对降解影响不显著,而Zn 2+和Fe 3+均有不同程度的抑制作用,其中Zn 2+最为明显。Mn 2+对2#

22、的芘降解有促进作用,这可能是由于Mn 2+是一些微生物酶的激活剂,可以加快微生物的生化反应。2.4外加碳源对优良菌降解芘的影响图6中可以看出葡萄糖对2#、9#各菌的降解均有促进作用,其中对2#菌的促进较为明显,48h 可以使降解率提高4%。这可能是由于葡萄糖是微生物生长的良好的营养物质,它的存在使菌体生命活动加强,对芘的代谢能力进一步加强。脲对2#菌的降解有抑制作用,对9#菌的降解几乎无影响。其抑制作用很可能是由于脲与芘产生竞争代谢引起的,这一原因有待证实。46第1期3结论(1以焦化厂废水沟底泥为菌源驯化分离筛选出6株菌,保存了一组天然混合菌。研究结果表明,各多环芳烃优势菌的菌体表面疏水性不同

23、,且这种不同可以影响到反应初期菌株对芘的表观降解率,总的来说菌体的疏水性表面较亲水性表面对多环芳烃有更强的吸附性。菌种的表面疏水性在降解芘的过程中会发生变化,总的趋势是疏水性表面疏水性变小,亲水性表面疏水性变大。获得的一组天然混合菌对芘降解率较低,说明天然混合菌并一定是降解多环芳烃的优势组合菌。另外,多环芳烃降解菌在芘培养液中生长能力和降解能力没有必然联系。(2采用生物摇床进行单因素试验,对两株表面疏水性质相差较大菌株在不同环境条件下的芘降解性能研究结果表明:2#菌、9#菌对芘的降解受温度的影响,对于2#菌30是其降解率高的最佳温度,48h 内芘降解率可达23.57%,温度降低或增大降解率都减

24、小;对于9#菌40是其降解的最佳温度,48h时降解率达28.06%。Mn2+对2#的芘降解有促进作用,对9#菌几乎无影响;Cu2+对各菌对芘的降解均有不同程度的抑制作用,Zn2+、Co2+、Mo6+、Fe3+各离子对优良菌降解芘的作用好坏视菌种类而定,对于不同的菌,其影响结果不同。其它碳源的影响实验表明葡萄糖对于2#菌和9#菌的芘降解是一个有利的因素。参考文献1戴树桂.环境化学M.北京:高等教育出版社,2002:318.Dai Shu-gui.Environmental ChemistryM.Beijing:Higher Education Press,2002:318.(in Chinese

25、2Kim Y H,Freeman J P,Moody J D,et al.Effects of pHon the degradation of phenanthrene and pyrene by My-cobacterium vanbaalenii PYR-1J.Applied Microbiology and Biotechnology,2005,67:275-285.3Guo C L,Zhou H W,Wong Y S,et al.Isolation of PAH-degrading bacteria from mangrove sediments and their biodegradation potentialJ.Mar Pollut Bull,2005,51:1054-1061.4Kanaly R A,Bartha R,Watanabe K,et al.Rapid mineral-iz