分子生物学常用技术原理

1、Genetic engineering重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉分子生物学常用技术原理 相关概念相关概念DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体 基本原理基本原理 重组重组DNA技术应用技术应用本节主要内容本节主要内容克隆

2、克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无，即无性繁殖。性繁殖。技术水平：分子克隆技术水平：分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(

3、genetic engineering) 利用基因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物个体的特征及相关的工作称基因工程，、 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶多核甘酸激酶等多核甘酸激酶等重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷

4、酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚聚合、合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第第二链合成，双链二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行

5、填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶1、概念、概念限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGC

6、CTAGGATCC GBam H第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口3、限制性核酸内

7、切酶的识别和切割位点、限制性核酸内切酶的识别和切割位点Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口5 G AATTC.33 CTTAA G.55G AATTC.33CTTAA G55CTGCA G 3 3 G ACGTC55CTGCA G33G ACGTC5作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。*分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）（二）、其它工具酶（二）、其它工具酶1、DN

8、A连接酶连接酶、三、载体三、载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA粘粒粘粒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。多肽链而特意设计的载体

9、称为表达载体。三、载体三、载体此处是标题wanghome表表 达达 载载 体体载体的选择标准载体的选择标准 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。（一）、（一）、 质粒质粒 (plasmid)特点特点: :能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL

10、系列（置换型，适用基因组克隆系列（置换型，适用基因组克隆）. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列（三）（三） 粘性质粒粘性质粒(cosmid)其它：如其它：如酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)用动物病毒用动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）重组重组DNA(r

11、ecombinant DNA) -分子克隆分子克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 DNA克隆) 。 四、重组四、重组DNA技术的基本原理技术的基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基

12、因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录（一）目的基因的制备（一）目的基因的制备1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) * 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细

13、胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外

14、包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录（二）目的基因与载体的连接（二）目的基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)

15、同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连

16、目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。

17、目目 录录 2. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。3. 平端连接平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平适用于：限制性内切酶切割产生的平端端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3

18、 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录4. 4. 人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头及其应

19、用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（三）重组（三）重组DNA导入受体菌导入受体菌（四）重组体的筛选和鉴定（四）重组体的筛选和鉴定 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择（遗传学方法）抗药性标记选择（遗传学方法）(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子

20、杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等 3. 基因重组与表达技术 基因来源基因来源: 酶切片段酶切片段 mRNA cDNA (RT-PCR) PCR产物产物 化学合成：单链寡核苷酸化学合成：单链寡核苷酸互补寡核苷酸链退火时互补寡核苷酸链退火时,注意温度变化要非常的缓慢注意温度变化要非常的缓慢,有利有利于寡核苷链完全正确互补成双链于寡核苷链完全正确互补成双链 (95 自然冷却至室温自然冷却至室温)克隆重组克隆重组克隆载体的选择克隆载体的选择 抗生素双抗性载体：抗生素双抗性载体： 互补筛选互补筛选: p

21、UC19 pBluecript II 基因与载体的连接基因与载体的连接 外源片段与载体的比例：平端外源片段与载体的比例：平端 (3-10):1，粘端，粘端 1:1转化宿主转化宿主:JM109 DH5 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定抗药性标志的选择pBR322AmpTet重组子的筛选与鉴重组子的筛选与鉴定定AmN2H 宿主宿主菌菌重组子的筛选与鉴定蓝白筛选重组子的筛选与鉴定蓝白筛选原理原理原理原理蓝白斑筛选蓝白斑筛选 互补：互补：laz编码的编码的肽链肽链；半乳糖苷酶突变体半乳糖苷酶突变体-互补（互补（-complementation）：）：在在T-vector或或 PUC质粒序列中，插入

22、了质粒序列中，插入了lac启动子启动子-操纵操纵子基因序列以及编码子基因序列以及编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N-端端145个氨基酸的个氨基酸的核苷酸序列（又称核苷酸序列（又称-肽）；肽）；这类载体对应的宿主菌（如这类载体对应的宿主菌（如JM、DH5系列）系列）-半乳半乳糖苷酶基因失去了编码糖苷酶基因失去了编码-肽碱基序列肽碱基序列只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的只有当这类载体引入到宿主菌后，载体上的-半乳糖半乳糖苷酶苷酶N-端片端才能与宿主菌的缺陷端片端才能与宿主菌的缺陷-半乳糖苷酶互补，半乳糖苷酶互补，产生有活性的产生有活性的-半乳糖苷酶，这种作用称为半乳糖苷酶，这种作用称为-互补。互补

23、。重组子鉴定挑分离良好，大小中等的菌挑分离良好，大小中等的菌落培养落培养5ml菌液菌液小量制备质粒小量制备质粒酶切，琼脂糖凝胶电酶切，琼脂糖凝胶电泳泳测序测序基因表达 选择表达系统 原核系统 真核酵母 动物细胞 植物细胞 构建表达载体 重组克隆载体 表达载体 目的基因亚克隆目的基因亚克隆 正确的正确的ORF 导入细胞导入细胞: 化学方法（化学方法（CaCl2)、电转化、电转化 、显微注射、显微注射、 基因枪基因枪 外源基因表达外源基因表达: 化学诱导、温度诱导化学诱导、温度诱导 基因表达检测基因表达检测: SDS-PAGE 、RT-PCR、Western Blot亚克隆亚克隆一、定义一、定义

24、将克隆将克隆DNA片段从一个载体转移到另一个载体片段从一个载体转移到另一个载体二、应用二、应用 研究克隆研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆片段其中的一段序列克隆 DNA片段的表达片段的表达( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择目目 录录组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标志补救标志补救 互补互补目目 录录 互互补补的的检检测测目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录Southern印迹印迹目目 录录鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋

25、白的克隆和检出目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选

26、表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（五）克隆基因的表达（五）克隆基因的表达1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性

27、包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目目 录录优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动

28、物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱目目 录录目目 录录 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些

29、肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。或插入等突变。（

30、三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断标准标准. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查大人群普查。（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的

31、。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)分子生物学常用技术 凝胶电泳() 分子杂交() 聚合酶链反应(PCR)技术() DNA的物理图谱 DNA序列测定 基因芯片第一节 凝胶电泳(gel electrophoresis) 电泳概念 基本原理 Q 6r : 迁移率 Q : 电荷量 r : 粒子半径（分子量） : 介质粘度 电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量 凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳() 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）分离核酸原理 电荷

32、效应 分子筛效应 分子构象琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理 操作要点 应用范围1. 电荷效应 核酸是两性电解质 pH = 3.5 , 正电荷 pH = 8.08.3 , 负电荷，正极2.分子筛效应 小分子移动快 ，大分子移动慢3. 分子构象 闭环超螺旋线状DNA开环DNA +-（二）操作要点 支持物 凝胶浓度的选择 DNA分子量标准 电泳缓冲液 样品制备 电泳条件 DNA电泳染色 DNA片段的回收 1. 支持物商品化的琼脂糖琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点8090100ng 上样缓冲液 50%甘油/蔗糖 0.5%溴酚蓝/二甲苯青 点 样6

33、.电泳条件 潜水电泳 恒压电泳 低压: 12V/cm 中压: 810V/cm 高压：几十V/cm 温度：1525 潜水电泳7.电泳染色 溴乙锭(ethidium bromide, EB) 结构及染色原理 染色方法加入凝胶液中 电泳结束后染色 EB染色原理紫外灯下显色8. DNA片段的回收 低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法(5kb) DEAE-纤维素膜法(0.55kb)（三）应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定 杂交分析 PCR产物的分离鉴定 第二节 分子杂交 分子杂交的基本原理 固相支持物 探针 几种常用杂交技术一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性n核酸

34、分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理复性复性RNADNA杂交条件 靶分子-支持物 探针 杂交袋 杂交炉杂交种类 被检核酸种类和方法 原位杂交斑点杂交

35、Southern杂交Northern杂交Western杂交 反应介质 液相杂交 固相杂交()二、固相支持物 硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane) 尼龙膜(nylon membrane)1.硝酸纤维素滤膜 特点吸附ssDNA和RNA 本底低 不足不适于重复杂交滤膜较脆 不适于电转移法 对DNA小片段(缺口翻译 操作简便 DNA/cDNA 探针 DNA的5末端标记(5end labeling) 碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶 标记原理 制备寡核苷酸探针 制备短的DNA/RNA探针 （一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理

36、方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术（二）探针技术二、印迹技

37、术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹 (Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 3 3、应用：、应用：（1 1）检测某一组织或细胞中已知的特异）检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNAmRNA的表达水平的表达水平（2 2）比较不同组织和细胞

38、中的同一基因的）比较不同组织和细胞中的同一基因的 表达情况表达情况（三）蛋白质印迹（三）蛋白质印迹 (Western Blot) (Western Blot) 1 1、概念：、概念： 蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到蛋白质在电泳之后可以被从胶中转移和固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结模型材料上，再与溶液中相应的蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免合，其中最常用的是用抗体检测，因此被称为免疫印迹。相对于疫印迹。相对于DNADNA的的Southern BlotSouthern Blot和和RNARNA的的Southern BlotSouthern Blot

39、，蛋白质印迹被称为，蛋白质印迹被称为Western BlotWestern Blot。2 2、基本过程：、基本过程： (1) (1) 电泳（电泳（ElectrophoresisElectrophoresis）：）： 一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。互间的聚集。 最常用的方法是将强阴离子去污剂最常用的方法是将强阴离子去污剂SDSSDS与某一与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。于电泳凝胶上

40、。 蛋白质从蛋白质从SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体。体。 目前进行的目前进行的WesternWestern印迹反应大多还是从凝胶上印迹反应大多还是从凝胶上直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋直接把蛋白质电转移至硝酸纤维素滤膜之上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。白质的转移只有靠电转移方可实现。 (2) (2) 转膜转膜(Transfer)(Transfer)：(3)(3)封闭封闭(Blocking)(Blocking)： 封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非封闭可能结合非相关蛋白的位点以降低这类非特异性结合背景的效果。特异性结合背景的效果。

41、现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为现已设计的封闭液有多种，其中脱脂奶粉最为价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免价廉物美，既使用方便又可与通常使用的所有免疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛疫学检测系统兼容。只有一种情况，也就是当牛奶中可能含有要用奶中可能含有要用WestemWestem印迹法检测的蛋白质印迹法检测的蛋白质时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。时，不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。(4)(4)一抗孵育一抗孵育(Primary antibody incubation)(Primary antibody incubation)： 特异性抗体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分特异性抗

42、体（一抗）和转移膜上相应的蛋白分子结合子结合. .(5)(5)二抗孵育二抗孵育(Secondary antibody incubation)(Secondary antibody incubation)： 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)或放射性核或放射性核素标记的二抗与之反应。素标记的二抗与之反应。 二抗需根据一抗进行选二抗需根据一抗进行选择。择。 (6)(6)显色：显色：用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的用放射自显影或底物显色检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度敏感度. .放放射射自自显显

43、影影照照片片n其他：其他：斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵点阵 (DNA array) DNA芯片技术芯片技术 (DNA chip)三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片DNA点阵点阵n核酸序列分析的基本原理：核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法) DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (Sanger法法)第三节第三节核酸序列分析核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis一、

44、一、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddCn链末端合成终止法测定链末端合成终止法测定DNA序列的原理序列的原理二、二、DNA自动测序自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛

45、细管电泳）分离后，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 ddGddAddTddC红色红色荧光荧光绿色绿色荧光荧光黄色黄色荧光荧光蓝色蓝色荧光荧光电泳电泳DNA序列自动分析原理及结果图序列自动分析原理及结果图四、Southern 杂交 Southern blotting/DNA blotting 1975年，Edwen Southern等 印迹(blot

46、ting) : 转移 blot: a spot or mark, esp. of ink blotting 1. 印迹的方法 毛细管转移法 电转移法 真空转移法 毛细管转移法 电转移法2. Southern 杂交的步骤五、Northern 杂交 RNA blotting 步骤 总RNA/mRNA变性电泳分离转移杂交放射自显影/化学显色 应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量 比较不同组织/细胞中基因的表达情况 Northern 杂交六、Western 杂交 免疫印迹(immunoblotting) SDS-PAGE转移蛋白第一抗体标记的第二抗体(探针)检测 应用-蛋白质的定性定量分析免疫印迹

47、Southern,Northern & Western待测物质 支持物 探针 转移方式Southern DNANC 单链核酸 毛细管/电/真空 Northern RNANC/尼龙 单链核酸 毛细管/电/真空 Western 蛋白质NC/PVDF 抗体电转移 第二节第二节聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的技术的工作原理工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

48、5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。 模板模板DNA 特异性引物特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第三节 PCR技术 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) PCR的基本原理和步骤 PCR的影响因素一、PCR的基本原理和步骤 基本原理DNA复制 三个步骤变性(denaturation) 退火(annealing) 延伸(ex

49、tension) 标准的PCR反应体系 10X 扩增缓冲液： 10ul 模板DNA: 0.12ug 引物： 各0.21umol/L 4种dNTP: 各200umol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U 总体积： 100ul二、PCR的影响因素 模板 pg-ug 引物 0.1-0.5uM Taq DNA聚合酶 1-5U 4种dNTP 20-200uM Mg2+ 1.5-2.5mM 过高: 非特异扩增 过低 : 反应产物减少 循环条件 25-35 引物长度：1530nt G+C含量：4060% 碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补 引物的3端 引物的5端

50、引物浓度：0.21umol/L 自动搜索：Primer Premier 5.0 在线设计：/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi 分析评价：Oligo 6.0循环条件 变性温度和时间: 9096, 3060s 退火温度和时间: 4060, 3060sTm=4(G+C)+2(A+T) 延伸温度和时间7075 (72 )1kb, 1min; 34kb , 34min; 10kb,15min 循环次数: 2535 次 聚合酶链聚合酶链式式反应反应1. Denaturation2. Annealing3. ExtensionPCR.

51、EXE5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。Essential ComponentsEssential Components of of PCR ReactionPCR Reaction salts (ions)利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获得已知目的基因片段得已知

52、目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆基因。基因。 二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆利用利用PCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。变等改造。 PC

53、R技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性 。（四）（四）DNA序列测定

54、序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是是将将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术 原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单是在组织切片或细胞涂片上的单

55、个细胞内进行的个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测杂交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中是否在该组织或细胞中存在。存在。 原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术荧光定量PCR技术 原理原理 荧光探针：荧光探针：(1) Molecular Beacon (2)TaqMan Molecular BeaconQ淬淬灭灭R 发光发光 特异性荧特异性

56、荧光双标记光双标记探针探针 Taq酶酶 5353外切酶活外切酶活性性(2) TaqManRQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）定量定量: : 通过外标准来定量未知样品通过外标准来定量未知样品 标准品制备 1、 标准菌标准菌 2 、构建质粒、构建质粒 3 、化学合成基因片段、化学合成基因片段 标准品的定量标准品的定量 1、 标准菌：拷贝数已知标准菌：拷贝数已知（卫生部）（卫生部） 2 、无限梯度稀释无限梯度稀释： 高浓度按高浓度按10倍浓度梯度逐渐稀释倍浓度梯度逐渐稀释10n 10n-1 101 0 荧光定量P

57、CR设计流程靶基的选择靶基的选择设计引物与探针设计引物与探针制作标准曲线制作标准曲线 预实验：特异性敏感性预实验：特异性敏感性（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355基因克隆技术 c差示分析法大规模克隆技术gene map-based cloningRACE(rapid amp

58、lification of cDNA)技术 可以扩增缺失的DNA序列。 可以完成3和5的未知序列的扩增。5扩增3扩增文库的构建与筛选 文库 c文库 筛选方法 基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library) cDNA文库文库(cDNA library) n基因文库基因文库( (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码

59、区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达

60、信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、二、cDNA文库文库第五节第五节生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Technique是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作