非那西丁体外温孵实验

1、成员：成员： 1.肝微粒体温孵液中对乙酰氨肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定方法的建立。基酚浓度测定方法的建立。2.熟练操作熟练操作HPLC。3.了解肝微粒体。了解肝微粒体。实验内容实验内容n1.建立非那西丁体外温孵实验测定其代谢速率的实验方案。n2.开发大鼠肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚测定的方法，制备对乙酰氨基酚的标准曲线，并采用HPLC法建立标准曲线用于肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度测定。肝微粒体简介肝微粒体简介n肝细胞内还含有肝微粒体，是药物代谢及生物转化的重要场所。肝微粒体实质上由内质网碎片和核糖核酸颗粒组成。内含多种与过氧化氢有关的酶系，又称过氧小体，内含胆固醇合成酶系，类固醇，

2、胆红素和药物结合酶系，以及与药物代谢有关的酶系，可使脂溶性药物代谢可使脂溶性药物代谢成水溶性药物，经肾脏排泄。成水溶性药物，经肾脏排泄。肝微粒体受到损害时，药物代谢发生障碍，药物作用时间延长。n制备肝微粒体的方法有超速离心法、钙沉淀法钙沉淀法、聚乙二醇法等。 实验过程实验过程一、肝微粒体温孵液的制备。一、肝微粒体温孵液的制备。 肝微粒体的制备方法:1.取大鼠禁食24h,断头处死放尽血液，迅速剖开腹腔取出肝脏，剪碎肝组织，用预冷的Tris缓冲液洗净血污，再用滤纸吸干表面水分后称重，按1:3加入PBS后，加水至1000ml，冰浴，用玻璃匀浆器制成肝匀浆，于4C，12500r离心20min，取上清液

3、，与88mmol/LCaCl2 混匀，4C27000离心20min，取沉淀，再用0.1mmol/LTris缓冲液冲洗，4C27000离心缓冲20min，取沉淀。实验过程实验过程2.重悬沉淀重悬沉淀 将沉淀物悬浮于含20%甘油的磷酸钾缓冲液中（1g组织加入1ml含20%甘油的磷酸钾缓冲液），反复在冰水浴中吹打均匀，冻存管分装后置-80冰箱内保存待用。 3.蛋白定量蛋白定量 采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。二、温孵实验。二、温孵实验。肝微粒体（0.2mg/mL,80L），非那西丁溶液（5，7. 5，10，15，20，25，30，40，60，80，100mol/L ）,100 mmol/L 磷酸钾

4、缓冲（pH7.4）37水浴预温孵5min。加入NADPH体系溶液（10 mmol/L 葡糖 6 磷酸、1 Um/L 葡糖 6 磷酸脱氢酶，4mmol/L氯化镁，启动剂，40L），在37水浴温孵30min后， 加入冰甲醇（终止试剂，100L），终止温孵。实验过程实验过程实验过程实验过程（为了考察大鼠微粒体反应中合适的终止试剂，对冰甲醇和冰乙腈的终止效果进行比较分析。发现选用冰乙腈作为终止试剂时，对乙酰氨基酚出峰位置存在干扰，而选用冰甲醇时，无内源性干扰，因此选用冰甲醇作为终止试剂。）4下12000r/min离心15min，取上清液40L进行HPLC分析。 实验过程实验过程三、三、HPLC测定肝微

5、粒体温孵液中对乙酰测定肝微粒体温孵液中对乙酰氨基酚浓度。氨基酚浓度。色谱条件：Shimadzu Shim Pack VP ODS 柱( 150 mm 4. 6 mm，5 m)流速：1.0mL/min柱温：室温检测波长：245nm采用梯度洗脱：流动相A为100mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH4.3），B为乙腈。 0 12 min，A B( 90 10) ， 12 17 min，A B( 75 25) ， 17 29 min，A B( 75 25) ，29 35 min，A B( 90 10) ， 35 40 min，A B( 90 10) HPLC 四、建立标准曲线与测定非那西丁体外温四、建立标准曲线与测定非那西丁体外温孵液代谢速率。孵液代谢速率。建立对乙酰氨基酚建立对乙酰氨基酚标准曲线标准曲线n取对乙酰氨基酚储备液，已含有失活微粒体的甲醇水溶液( 1 1) 稀释成0. 2，1，2，5，10，20 mol/L 的系列标准微粒体样品，分别加入等体积的内标( 10 mol/L间乙酰氨基酚) ，取20 L 按照色谱条件进行HPLC 分析，测定对乙酰氨基酚含量。n以对乙酰氨基酚与内标峰面积比值( Y) 为纵坐标，对乙酰氨基酚浓度( X，mol/L ) 为横坐标，绘制标准曲线。数据处理数据处理n记录HPLC中对乙酰氨基酚和间乙酰氨基酚的峰面积，通过标准曲线计算出产