酵母双杂总结

1、酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测

2、蛋白蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA

3、(E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 1 易于转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA结合结构域(如GAL4-bd，

4、 LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交文库构建基本实验流程一 第一链cDNA合成1. 准备高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂 RNA 样本 (0.0251.0 g poly A+或0.102.0 g 总RNA)12 l1.0 l CDS III 12 l去离子水补齐体系到4.0 l注: 对照实验时，请使用1g的对照RNA。CDSIII = Oligo-

5、dT；CDSIII/6 =随机引物 3. 72°C ，孵育2 min。4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10s，瞬时离心。5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。5X First-Strand 缓冲液2.0 lDTT (100 mM)1.0 ldNTP 混合物(10 mM )1.0 lSMART MMLV 反转录酶1.0 l 6. 42°C，孵育10 min。7. 加入 1 l SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 h。 8. 75°C ，10 min终

6、止第一链合成反应。 9. 室温冷却，加入1 l RNA酶H (2U)。 10. 37°C，孵育20 min。 11. 继续进行 LD-PCR 扩增。 二 第二链cDNA合成（LD-PCR） 1. 建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组，往实验组离心管中加入以下试剂并混合：第一链cDNA2 l蒸馏水70 l10X Advantage. 2 PCR缓冲液10 l50X dNTP 混合物2 l5PCR 引物2 l3PCR引物2 l10X溶解液10 l50X Advantage 2聚合酶混合物2 l总体积100 l2. 扩增程序：95°C30 sec x Cyc

7、les 95°C 10s68°C 6 min68°C5min3. 对每个样品取7 l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。三 CHROMA SPIN.+TE-400纯化柱纯化ds cDNA 1. 将剩余的93ul的cDNA样品加入CHROMA SPIN TE-400 纯化柱中，颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。移除顶端帽子，掰断柱底部的break away,将柱放置在2ml 的收集管中。2. 700 rpm，5 min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix半干。3. 将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul的样本。4. 70

8、0 rpm，5 min离心，样本便流到了收集管中。 5. 将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA： 加入 1/10体积的3 M 醋酸钠。加入2.5倍体积的冰乙醇 (95100%)。20°C ，1 hr放置沉淀。 14,000 ，室温离心20 min。 弃上清，14,000 rpm瞬时离心，去除残留的上清液。 空气干燥10 min。 6. 20 l 去离子水重悬cDNA，用于酵母文库构建。四 建立Mate & Plate 文库1. 遵循酵母转化系统文库规模酵母转化操作，向0.5ml Y187感受态中共转化下列组份：已纯化的ds cDNA25 gpGADT7

9、-Rec (0.5 g/l)6 l2. 按照转化操作的第二步，将酵母重悬于15ml 0.9% (w/v) NaCl中。3.将100 l 的 1/10 、1/100稀释液分别铺板于 SD/Leu 100 mm 固体培养基上， 30°C，孵育 34d，确定文库的库容。4. 将剩下的悬浮液铺板于150 mm SD/Leu选择培养基上，每板100 l 悬浮液，约使用150板，30°C 孵育3-4d 5. 收获Step4中的转化子： a. 4°C ，34 h冷却培养板。b. 加入5 ml 的冻存液（YPDA/25%甘油）。 c. 使用无菌的玻璃珠分离菌落（缓缓地摇晃培养板，

10、玻璃珠均匀地滚动于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中）。d. 将所有的液体收集于无菌的单管中(收集后的体积要达到0.5 L)。 e.用血球计数板来计算细胞密度，若细胞密度小于<2 x 107/ml，离心来减少悬浮液的体积。 f. 将文库分装到2ml的离心管中（1ml/管）， -80贮存。 6. 取1ml单管文库进行筛选。 酵母细胞感受态的制备及转化小样转化文库转化1 在转化实验的两天前，于YPD培养基的平皿上活化酵母菌株(Y2H/Y187)。2.  转化前一天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C，200rpm培养8-12

11、h。3. 取5l上述酵母细胞液于50ml的YPDA培养基中，   30°C，200rpm培养8-12h至OD600>1.5。50ml150ml4.将上述酵母细胞液离心后转接到新的YPDA液体培养基中，使OD600=0.2，30°C 200rpm培养4-6h，使OD600=0.5 300ml1L5. 700g 离心 5分钟收集酵母细胞，用无菌水或TE洗酵母细胞。25-50ml500ml6.  再次700g 离心 5分钟。7.  弃上清，用1.1

12、5;TE/LiAc重悬酵母细胞。1.5ml8ml8. 往离心管里加入如下试剂及DNA: DNA-BD/baita AD/library Herring testes carrier DNA 0.1 g0.1 g0.1 mg0.21.0 mg0.10.5 mg20 mg9. 加入感受态细胞，吸打均匀0.1 ml8 ml10. 加入PEG/LiAc缓冲液，高速漩涡混合0.6 ml60 ml11. 200rpm,30度孵育30min12. 加入DMSO，轻轻混合70 l7.0 ml13. 42度，40min水浴14. 冰浴1-2min15. 室温高速离心(14000g)5s5min16. 弃上清，用

13、1×TE重悬，进行涂皿操作0.5ml10ml酵母文库的筛选A 诱饵质粒自激活活性检测和毒性检测1. 诱饵载体和对照空载体转化酵母Y2H细胞，取100L涂布SD/-Trp固体培养板，30°C倒置培养3-4天待菌落长出。2. 挑(2-3 mm)单克隆至50 ml SD/Trp 液体培养基中，30°C摇床230-260 rpm，16-24 hr后，菌落PCR检测目的基因是否转入Y2H中，-70°C保存阳性菌种。3. 将阳性克隆在SD/-Trp/X-gal(SDO/X) SD/-Trp/X-gal/Aba(SDO/X/A)平板上划线，30°C倒置培养2

14、天。4观察有无蓝色菌斑的出现，菌斑不显蓝色则表明无自我激活活性；若实验菌斑与对照生长状况相同，则诱饵载体对酵母无毒。 注：所需涂的皿及其生长结果如下表：sampleSelective agar plate2mm colonycolourY2HpGBKT7:baitSDOSD/-TrpYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/ X-GalYeswhiteY2HpGBKT7:baitSDO/ X-Gal /AbaNOnoY2HpGBKT7:Lam+Y187pGADT7-TDDO/ X-Gal /AbaNONOY2HpGBKT7:53+Y187pGADT7-TDDO/ X-Gal /Aba

15、YesblueB 结合实验及筛库1在冰上冻融1ml文库（酵母菌株 2 x 107cells Y187文库）。2在2L三角瓶中，加入5ml 含Y2H酵母菌（1 x 109cells/ ml目的蛋白bait）的培养基和上述冻融的1ml文库。3加入45ml 2×YPDA/Kan (50g/ml)，30-50rpm，30，mating 20-24小时，mating 20小时后可取5l到显微镜下观察，如还没有结合子存在，再mating 4小时，否则停止mating进入下面操作。4 准备SD/Ade/His/Leu/Trp（QDO）培养基平板，约150个（涂皿前应在超净工作台上吹2-3小时）。5

16、转移mating体系至2个50ml离心管中，1000g室温离心10分钟，弃上清液。然后再加入2×YPDA洗一次酵母细胞，1000g室温离心10分钟，弃上清液。再用灭菌水清洗酵母细胞，两管合并，1000g室温离心10分钟，弃上清液，加入约10 ml灭菌水重悬酵母细胞。6 涂皿，每平板加入150l上述悬浮酵母细胞用玻璃珠涂开至无流动液体。 7 封皿后置于30恒温生长箱，生长4-6天后，选取菌斑大于2mm的菌落，在QDO平板皿上划线，2-3d后长出的菌落可挑出来做插入片段扩增PCR。8 将（7）中扩增片段大小不同（PCR验证3次，可大大降低假阳性菌落（约40%）的菌落于QDO、QDO/X-

17、Gal和QDO/X-Gal/Aba培养基上划线（可适当增大X-Gal和Aba的浓度，以提高筛选的严谨性），封皿后置于30恒温生长箱，生长2-3d后观察生长状况。若在QDO上生长，QDO/X-Gal菌落变蓝，QDO/X-Gal/Aba不生长，则存在互作。将存在互作的菌落进行菌落PCR，将PCR产物送去测序，对测序结果进行分析，看是否存在与花粉的发育、能量传递和合成、核酸结合或者剪切、毒性蛋白等相关的基因。9 挑互作酵母菌株至2ml 2×YPDA中，30°C摇床230-260 rpm，16-24 hr，提取酵母质粒，再转入大肠杆菌中扩增含目的基因的载体，测序，到数据库中比对测序结果，标记感兴趣的互作蛋白。