植物热激蛋白90的分子作用机理及其利用研究进展

1、植物热激蛋白90的分子作用机理及其利用研究进展裴丽丽1,2，徐兆师1*，郑天慧尹丽娟1，李连城1，陈 明1，郭玉华2*，马有志1（1中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室，北京 100081；2沈阳农业大学农学院，辽宁沈阳 110866）摘要：热激蛋白90（heat shock protein 90，HSP正文HSP都是大写，参考文献有的是Hsp？ 两种表示方法都是正确的90）广泛介导了胁迫信号的传递，在控制人体细胞正常生长和促进肿瘤细胞发育中起着重要作用；目前，HSP90已成为细胞免疫、信号转导以及抗肿瘤研究的前沿课题。植物H

2、SP90的生理功能研究起步较晚，最近的研究发现，HSP90在植物发育、胁迫环境的应答以及抗病性中起着重要作用。本文从HSP90的分子生物学角度功能进行讨论，系统地综述了近几年植物HSP90分子作用机理研究的最新进展，以及在改良植物抗性上的功能应用，以期为通过基因工程方法改良作物抗性提供理论基础参考。关键词：植物热激蛋白90HSP90；分子特性；作用机理；抗病性；非生物胁迫抗性Molecular Mechanism and Application of HSP90 in PlantsPEI Li-li1,2, XU Zhao-shi1, ZHENG Tian-huiYIN Li-juan1, L

3、I Lian-cheng1, CHEN Ming1, GUO Yu-hua2, MA You-zhi1（1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 2College of Agronomy

4、, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866）Abstract: Heat shock protein 90 (HSP90) widely mediated stress signal transduction, and plays an important role in the control of normal growth of human cells and in the promoting tumor cell development. At present, HSP90 has become forefront proje

5、cts of cellular immunity, signal transduction and anti-cancer investigation. The physiological function of HSP90 start later in plant than in animal and fungi. Recent researches revealed that plant HSP90 plays an important role in development, environmental stress response and disease resistance. Th

6、is paper discussed the molecular functions of HSP90, and systematically reviews latest progresses on molecular mechanism of plant HSP90 as well as improvement of plant resistance to facalitate broaden work.Key words: Plant HSP90; Molecular characteristic; Mechanism of action; Disease tolerance; Abio

7、tic stress resistance收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（31171546）；转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009-083B）。作者简介：裴丽丽（1986-），女，山西平遥人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。通讯作者：徐兆师（1976-），男，山东胶南人，副研究员，博士，硕士生导师，研究方向为植物抗逆分子生物学。TelE-mail：xuzhaoshi；郭玉华（1957-），女，辽宁沈阳人，教授，博士，博士生导师，研究方向为水稻遗传育种。TelE-mail：guoyuhua2006。Mo

8、lecular Mechanism and Application of HSP90 in PlantsPEI Li-Li1,2, XU Zhao-Shi1*, ZHENG Tian-Hui1, LI Lian-Cheng1, CHEN Ming1, GUO Yu-Hua2*, and MA You-Zhi11Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key La

9、boratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 2College of Agronomy, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866.Abstract: Heat shock protein 90 (HSP90) widely mediated stress signal transduction, and plays an important role in the control of normal growth o

10、f human cells and in the promoting tumor cell development. At present, HSP90 has become forefront projects of cellular immunity, signal transduction and anti-cancer investigation. The physiological function of HSP90 start later in plant than in animal and fungi. Recent researches revealed that plant

11、 HSP90 plays an important role in development, environmental stress response and disease resistance. This paper discussed the molecular functions of HSP90, and systematically reviews latest progresses on molecular mechanism of plant HSP90 as well as improvement of plant resistance to facalitate broa

12、den work.Key words: Plant HSP90; Molecular characteristic; Mechanism of action; Disease tolerance; Abiotic stress resistance热激蛋白（heat shock proteins，HSPs）广泛分布于真菌、动物和植物细胞中，在高温胁迫环境下，热激蛋白合成显著增加，在生物细胞热应激反应中发挥重要作用1。在正常生理状态下，HSPs主要存在于细胞质中；应激状态时，HSPs迅速进入细胞核和核仁行使功能。按照分子量大小可以分为不同的家族，包括HSP110、HSP90、HSP70/HSP8

13、0、HSP60和小分子量HSP（smHSP）等2。Horwit31992年最早提出smHSP作为分子伴侣（molecular chaperones）的理论。现已证明HSP90、HSP70和HSP60都具有分子伴侣的作用。最近的研究结果显示，高分子量HSP90可能在生物胁迫应答反应中起重要作用。HSP90在分子进化上高度保守，参与调控、维持细胞内多种蛋白的构象和功能，使细胞在胁迫环境下正常存活4。在真菌和动物中，HSP90广泛介导了胁迫信号的传递，参与类固醇激素受体、激酶和转录因子的折叠、并激活底物，起始胁迫信号的传递5-8。最新研究发现，HSP90在控制人体细胞正常生长和促进肿瘤细胞发育中起着

14、重要作用8-9。很多癌基因蛋白均为HSP90的作用靶点，单一抑制HSP90能同时产生多路径抗肿瘤效应10-11；抑制HSP90的活性能促进癌基因蛋白的降解，有助于癌症治疗6,8,12,-14参考文献13未列出！。HSP90抑制剂有助于阻断细胞分裂，减慢肿瘤扩散；目前，临床上正在测试HSP90抑制剂治疗肿瘤的效果15。HSP90已成为抗肿瘤研究的前沿课题。然而，植物HSP90的生理功能研究起步较晚，。目前，HSP90在植物中的胁迫应答机理、分子伴侣的作用及其在提高植物抗逆性的功能尚不明确。最近，在拟南芥、烟草和水稻上的研究发现，HSP90在植物发育、对胁迫环境的应答以及抗病性中起着重要作用16。

15、据报道，HSP90可能在植物基因型变异到形态变化的转换中处于核心位置17。因此，深入研究植物HSP90在逆境条件下的功能，对正确认识胁迫信号的传导、抗逆相关基因的调控以及提高作物的抗逆性有着重要的指导意义和实际应用价值。本文综述了近几年植物HSP90分子作用机理研究的最新进展，以期推动植物热激蛋白研究工作的展开。1 HSP90的结构机理HSP90是一种高度保守并普遍存在于原核以及真核生物细胞中的分子伴侣，为真核生物生长发育所必需，。正常条件下HSP90约占总蛋白的1%2%，胁迫条件下可高达4%-6%5,18。HSP90能辅助蛋白的折叠、激活和成熟，并改变和维持参与信号转导的蛋白构象，在细胞的生

16、长过程中起着重要的作用4，因此HSP90功能的丧失会造成细胞的多种生理活性缺陷。HSP90是一个受ATP调节的二聚体分子伴侣，几乎所有HSP90家族成员的结构都很保守（图1），每个单体含有3个结构域：，即N端高度保守的ATPase结构域、，中间结构域（M）和介导HSP90二聚化的C端结构域18-, 3118-31?。ATP bindingNCharged regiondimerizationMCSubstrate binding图 1 HSP90的结构模型Fig. 1 A structural model of HSP90N：HSP90 N端结构域；M：HSP90中间结构域；C：HSP90 C

17、端结构域HSPsp90 consists of three domains: an N-terminal ATP-binding domain (N); a middle domain (M); and a C-terminal dimerization domain (C) with the pentapeptide MEEVD sequence. A charged region exists between the N and M domains. All three domains are reported to interact with substrate proteins.HSP

18、90的N端ATPase结构域是ATP/ADP结合位点，具有内源ATPase活性；。在ATP存在的情况下会发生构象变化，进而参与信号转导、蛋白折叠以及形态进化等（图3）。突变的结果显示ATPase活性是HSP90执行生物功能所必须需的31-32。一些自天然物质，如格尔德霉素（Geldanamycin）与这个位置高度亲和，干扰HSP90的功能，并且促进蛋白激酶的迅速降解33。HSP90中间结构域在HSP90结合底物蛋白过程中起了关键的作用。HSP90与二型拓扑异构酶DNA促旋酶B（GyrB）构成机理的相似性也说明了中间结构域是底物蛋白的主要结合位点。中间结构域有一个接触反应环可以感知ATP-磷酸盐

19、的存在并进攻。研究表明，单独的N端结构域是没有ATPase活性的，维持其完整活性需要中间结构域的参与34-35。HSP90的C端结构域是自身的二聚化位点、钙调蛋白结合位点和底物蛋白结合位点。真核生物细胞质HSP90的C端有一个保守的五肽结构（MEEVD），含有tetratricopeptide repeat （TPR）结构域的蛋白就是通过五肽结构识别HSP90并与之结合，从而使HSP90发挥不同的作用，这与HSP70末端8八个氨基酸残基（GPTIEEVD）与TPR的互作机理非常相似 6,31。另外，真核细胞HSP90的N端结构域和中间结构域之间有一段荷电区，由大约50个氨基酸残基组成36参考文

20、献37未列出！。荷电区对于HSP90的功能可有可无，主要是起到共价连接、协作助N端结构域和中间结构域的作用，以维持HSP90的ATP结合状态的构象。据报道，HSP90的3个结构域（N端、M端和C端）都参与了与底物蛋白的互作31。最近，Terasawa等31和Zuehlke和Johnson等8总结了HSP90与底物蛋白互作的一般原理，认为没有结合ATP的HSP90二聚体处于开放状态，可以通过分开的两个单体N端结构域来捕获底物蛋白；当N端结合ATP后蛋白构象发生变化，两个分开的N端会短暂的联合，HSP90分子夹闭合，形成环状结构，底物蛋白也被包裹在夹内。HSP90通过与底物蛋白结合，维持所谓“无活

21、性稳态”。真核生物HSP90需要辅蛋白和调控因子来调节自身与底物蛋白之间的相互作用，并赋予HSP90各种生理活性（图2）。HSP90的底物绝大多数是参与信号传递的激酶和或转录因子6，底物构象的维持都需要HSP90的参与。动物HSP90广泛参与了信号传递蛋白的合成、折叠以及DNA的修复，其重要性日益突显4,6,8,37-38。尤其HSP90作为抗肿瘤药物格尔德霉素的靶基因被报道以来33，在临床上受到越来越多的关注。然而，对植物HSP90的生物功能的研究较少，普遍认为与细菌、酵母及动物中的HSP90相似，主要参与协助蛋白折叠、蛋白复合体的装配和降解、激活底物或底物蛋白的生物活性等。TPR prot

22、ein(Hop/Stil, CHIP, UNC-45, FKBP51/52, CyP40, PP5, XAP2)HSP70/40P23Cdc37AhalKinasesTranscription factorsEnzymesCytoskeletonCell cycleGrowthApoptosisCancerStressDevelopmentEvolutionGenetic variationHSP90Co-chaperonesClientsProcessors图2 HSP90和辅蛋白通过与底物蛋白之间的互作在不同细胞发育过程中发挥作用4,6,28Fig. 2 Functions of HSP9

23、0 and co-chaperones by interaction with substrates in different developmental phases in cells 4,6,282 HSP90广泛参与植物生长发育过程HSP90主要定位于细胞质，也有少部分存在于内质网、线粒体和叶绿体等亚细胞器中19。HSP90通常以同源二聚体形式存在，在应急状态下合成增加，。目前已经从多种植物中克隆出HSP90基因。Marrs等20从玉米中分离到两个HSP90基因，对其表达模式和启动子进行了分析，然而其功能和作用模式未见报道。目前对拟南芥HSP90家族研究的较多，拟南芥中存在7个HSP90

24、成员：AtHSP90-1/-2/-3/-4/-5/-6/-7。其中，AtHSP90-2/-3/-4之间的蛋白序列高度相似，同源性高达96%，在功能上可能是冗余的。AtHSP90-1/-2/-3/-4在氨基酸序列的C末端含有特异的定位信号MEEVD，定位于细胞质；AtHSP90-5/-6/-7由N端的信号肽引导分别定位于叶绿体和线粒体中；AtHSP90-7含有C端KDEL内质网定位信号序列，定位于内质网上21-22。HSP90在植物生长发育进程中起着至关重要的作用，其功能残缺会引起植物生长形态畸形和生理特性的改变4,6。Queitsch等23用格尔德霉素（geldanamycin，GA）抑制拟南

25、芥HSP90的表达，导致拟南芥的表现型发生了变化，包括偏上性的子叶、圆盘或放射状对称的子叶及生长不正常的根毛23。拟南芥的HSP90-RNAi株系的的拟南芥子叶中积累较多的紫色素，真叶发育时间延迟而且叶形变窄，成株则表现为顶端优势丧失，多个原初花序同时发生，茎分生组织发育异常，莲座叶数量增多，开花时间延迟24。AtHSP90-5突变导致拟南芥对红光应答、氯酸盐抗性的改变和cr88突变体中组成型的叶绿体发育？的延迟25。AtHSP90-7的缺失导致拟南芥茎尖分生组织和花顶端分生组织膨大，根尖分生组织呈杂乱无序状，花粉管不能伸长。推测AtHSP90-7参与CLAVATA蛋白的折叠与组装，从而调控植

26、物CLV基因的活动，进而参与拟南芥分生组织的活动26。HSP90参与了植物胚的发育和种子萌发过程。Prasinos等27研究发现，AtHSP90-1在种子胚发育接近成熟时表达量剧烈增加，而AtHSP90-3则是在角果伸长期呈微弱稳定增长趋势，在胚接近成熟时略有下降，。说明HSP90在种子胚的形成和种子萌发过程中起调节作用，在不同的发育时期各成员的主次地位和作用各不相同。最近发现，HSP90还影响拟南芥下胚轴的伸长28。综上，HSP90可能广泛参与了植物的生长发育过程。在动物细胞质中的HSP90有两种亚型：，HSP90和HSP90。其中，HSP90易受热诱导，而HSP90易受有丝分裂诱导。在AT

27、P协助下，HSP90主要帮助受损蛋白的转运、折叠，防止聚集并恢复其正常构象；HSP90与类固醇激素利用有关29。HSP90在原核生物中的功能与真核生物不同，HSP90在但对原核生物的生长发育过程中也是不必要的30。3 HSP90介导了植物抗性在正常生理状态下，细胞蛋白的折叠并不需要HSP90的参与；，胁迫条件下HSP90可以促使损伤蛋白的修复。热激逆境会导致包括HSP90在内的很多HSP基因大量瞬时表达，这种表达受热激因子（Heat shock factor，HSF）的调控。HSP诱导的调控主要是在转录水平上。在HSP基因启动子上有热激元件（Heat shock element，HSE），为H

28、SF结合位点。在正常状态下，HSF以单体和HSP90二聚体相结合；在胁迫环境下，HSP与HSF分离去处理变形蛋白，激活的HSF结构发生变化，转化为三聚体形式紧密结合于HSE元件上，从而启动使HSP基因的转录39-40。不仅热激能诱导HSF的表达，其它如氧化、重金属和病虫害等许多逆境都能激活HSF的转录，从而进一步调控HSP的表达41。3.1 HSP90与植物抗病虫性近几年来发现，HSP90介导了植物的抗病信号传导途径。植物免疫由可识别病原体分子的Resistance（R）蛋白介导。植物HSP90与SGT1(suppressor of G2 allele of suppressor of kin

29、etochore proteinl)及RAR1(required for MLAl2 resistanceI)间的互作对R蛋白的活性稳定及植物对病原菌的识别起了很重要的作用。植物SGTl通过CS区域和TPR区域分别同HSP90的ATP酶区域和C末端互作，通过富含亮氨酸的重复区域(1eucine rich repeat，LRR)和R蛋白互作；RARl则同HSP90的ATP酶区域相互作用42。拟南芥HSP90复合物直接调控了抗病蛋白的活性，在R基因介导的抗病性中起着关键作用43。AtHSP90-2突变体植株都表现出R蛋白RPM1介导的抗病性受到削弱的现象44。HSP90在对番茄R基因Pto介导的丁

30、香假单胞杆菌抗性是必需的45。烟草HSP90与RAR1和TIR-NB-LRR蛋白互作，赋予植株烟草花叶病毒（TMV）抗性46。用BSMV-VIGS技术证实，SGTl、RARl和HSP90是否要斜体？基因分别在大麦Mla13介导的白粉病抗性和小麦Lr21介导叶锈病抗性中是必需的47-49。据推测，植物的抗病性可能也受FKBPs（FK506 binding proteins）和具有TPR结构域的辅蛋白的影响50。近几年发现，HSP90还参与了植物的抗虫信号传导途径。番茄Mi-1蛋白含有核苷酸结合位点（nucleotide-binding site，NBS）和LRR基序，介导了对根结线虫、马铃薯蚜虫

31、和白粉虱的抗性。用VIGS技术分别敲除降低SGTl、RARl和或HSP90的表达后，发现敲除降低SGTl和HSP90的表达减弱了番茄Mi-1介导的对根结线虫和马铃薯蚜虫的抗性，而RARl对这种抗性不是必需的51，这为SGTl和HSP90在番茄Mi-1介导的抗病虫中提供了资料。3.2 HSP90与植物非生物胁迫抗性植物HSP90的转录表达受各种逆境胁迫的诱导。在受到热、盐和重金属胁迫后，拟南芥HSP90表达量显著增加52-53；水稻HSP90受到盐、干旱、低温和ABA的诱导后也出现大量积累52,54-55。这表明植物HSP90介导参与了植物对非生物胁迫中信号途径的响应过程，但是具体的抗逆机制还不

32、清楚。最近研究表明，胞质HSP90特异性阻断剂诱导了拟南芥热诱导基因的累积和热适应性56-57。在正常环境下，胞质HSP90.2通过抑制HSF的功能，负向调控热诱导基因的转录；。热激环境下，胞质HSP90.2瞬时失活，HSF被激活，从而调控含有HSE（heat shock response element）元件的下游基因的表达56。随后，Nishizawa-Yokoi等57证实HSP90.2的过表达抑制了HsfA2转录；。相反，HSP90.2的抑制诱导了HsfA2转录，以适应氧化胁迫。McLellan等58得出了类似的结论，根基菌产生的HSP90抑制剂（radicalisin ？mo

33、nocillin I, MON）影响了植物的生长发育，增强了拟南芥的耐热性58。上述研究表明，植物HSP90在植物适应逆境环境过程中起着重要的作用。虽然植物HSP90参与了非生物胁迫响应，但是转基因改良植物抗性的研究并不多。刘大丽等59利用差异显示法从水稻中克隆的到HSP90热激蛋白90基因rHSP90，rHSP9基因？的过表达明显提高了烟草在盐胁迫下的生长势。在酵母中，HSP90通过HOG和MAPK途径分别参与酵母高渗和细胞壁胁迫过程60。植物中也存在MAPK胁迫信号途径，但是HSP90是否通过这条途径参与抗非生物逆境过程尚不清楚。与动物作用机理类似，植物辅蛋白调控了胞质HSP90的ATP酶

34、活性，协同HSP90与底物蛋白互作。拟南芥FKBP(FK506 binding protein)家族成员ROF1(FKBP62)通过TPR结构域与HSP90.1结合61。正常环境下，ROF1-HSP90.1复合体定位到细胞质中；，而在热胁迫环境下，ROF1-HSP90.1与HsfA2互作形成ROF1-HSP90.1-HsfA2复合体迁移到细胞核中，调控sHSP的转录表达，增强耐热性62。与ROF1作用模式相反，基因沉默ROF2(FKBP65，ROF1同源蛋白)基因增强了植株的耐热性，ROF2的核定位活性不依赖于HSP90.1或HsfA2，负向调控HsfA2的激活活性，抑制sHSP的转录表达63

35、。4 植物HSP90的研究展望在动物和真菌中，HSP90广泛介导了胁迫信号的传递，参与转录因子和蛋白激酶的折叠；。人类HSP90的高表达与肿瘤的发生、发展密切相关，其机制可能是增强了肿瘤细胞抗凋亡能力，。HSP的抗体或反义HSP为癌症的治疗提供了新的思路。越来越多的证据表明，HSP90受磷酸化的调控，然而目前对调控的作用机理尚不明确。近年来人们对HSP90分子结构和功能有了深入了解，发现了一些酵母和动物HSP90的互作蛋白，这对深入了解HSP90的功能及其作用机制是非常有益的。真核生物HSP90需要辅蛋白和调控因子来调节自身与底物蛋白之间的相互作用，并赋予HSP90各种生理活性。辅蛋白对于胞质

36、HSP90的功能起着关键作用，调控胞质HSP90的ATP酶活性，协同HSP90与底物蛋白的互作8, 37。与HSP90互作的辅蛋白大部分为TPR蛋白，主要依赖于TPR结构域与HSP90的C端保守五肽MEEVD结合。尽管植物中存在大量的TPR蛋白，但尚未见过与HSP90互作的植物TPR蛋白的报道。最近发现，Hsp90-p23与hTERT（telomerase reverse transcriptase）互作调控了端粒酶的活性功能，以维持端粒的正常运行64。另外，HSP90与亲环素A（CypA）选择性促进靶蛋白的迁移，但具体机理尚不清楚65。（此段不清楚展望什么？）植物HSP90的功能和作用机制的

37、研究起步较晚，虽然HSP90以及HSP90伴侣复合体在酵母、动物和植物中的功能非常保守，但实验证明，底物不尽相同。目前，HSP90在植物中的胁迫应答机理、分子伴侣的作用及其在提高植物抗逆性过程中的功能尚不明确，极少见到HSP90伴侣复合体生理学功能的报道。近几年发现，HSP90具有抵御植物疾病害以及遗传缓冲机制的作用，此发现拓宽了人们对HSP90的认识并引起了研究者们的极大兴趣。但植物HSP90潜在的具有普遍意义的重要作用尚未发现；，特别是植物HSP90系统的特性、定位于不同细胞器的HSP90功能和作用机制，以及HSP90在植物抗病虫和非生物胁迫过程中的具体途径还有待于进一步研究。环境胁迫、植

38、物抗性与HSP90之间的相互作用及分子机制的解析，对深入理解植物抗逆分子机理和作物抗逆分子育种具有重要的理论和实践意义。References参考文献SP有小写也有大写是根据原文章的题目而定。补充参考文献标识代码，期刊名不要斜体,参考文献59改为中文1 Lindquist S. The heat-shock responseJ. Annu Rev Biochem, 1986, 55: 1151-11911151-11912 Lindquist S, Craig E A. The heat-shock proteinsJ. Annu Rev Genetics, 1988, 22: 6316773

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