东南大学1265 分子生物学

1、基因是DNA 或 RNA 分子中有特定遗传功能的一段序列。 是能够表达和产生基因产物（蛋白质或RNA）的核苷酸序列。其内容可扩展至包括两侧对基因表达的起始和终止所必需的调控序列。顺式作用元件:(cis-acting element)是能影响基因表达，但不编码RNA和 蛋白质的DNA序列。包括启动子和上游启动子元件、反应元件、增强子Poly(A)、加尾信号 反式作用因子 (trans-acting factor)指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。启动子（promoter）是RNA聚合酶特异性识别结合和启动转录的DNA序列。有方向性，位于转录起始

2、位点上游。增强子（enhancer）能与反式作用因子结合，增强转录活性，在基因任意位置都有效、无方向性。C 值是一种生物单倍体基因组 DNA 的总量。 真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能 DNA 序列大多被不编码蛋白的 DNA 所隔开。这就是 C 值反常现象。DNA 的转座是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。根据转座作用机制的不同，可分为复制性转座和非复制性转座。 端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，由 RNA 和蛋白质构成，具逆转录活性，能够以自身的RNA 为模版，通过多次互补配对，延长染色体端粒 3末端。转座成分（transposable elements）又称移动基因（m

3、ovable genes），或称为跳跃基因（jumping genes）。指一些可以在染色体基因组上从一个位置转移到另一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁的 DNA 成分。转座是在转座酶的作用下，转座因子或是直接从原来位置上切离下来，然后插入新的位置，或是染色体上的 DNA 序列转录成 RNA，随后反转录为 cDNA，再插入染色体上新的位置。 端粒的功能人体细胞端粒长度约为 515 Kb，其功能在于保护染色体免受核酶降解，防止断端、融合、重排或降解。 如果端粒长度缩短到极限如4 Kb以下时，细胞则会丧失分裂增殖能力而发生凋亡。端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信号，端粒被称为细胞寿命的“分

4、裂钟”。端粒酶是依赖RNA的 DNA聚合酶，实质是一种逆转录酶。 能识别特定的端粒重复序列，以自身 RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC-3)为模板，合成新的端粒重复序列，使端粒延长，保持染色体的完整。 原核生物基因表达调控主要在转录水平，其次是翻译水平。原核生物基因表达调控主要在转录水平，即对RNA合成的调控。通常有两种方式： (1) 起始调控，即启动子调控，(2) 终止调控(衰减子调控) 转录的选择性：在细胞周期的某个阶段，或不同类型的细胞中，某些特定的基因被转录，而多数其它基因处于封闭状态，即转录有时间和空间上的严格调控。 核酸的凝胶电泳指按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，分

5、为琼脂糖(agarose)凝胶和聚丙烯酰胺(polyacrylamide) 凝胶，是分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 印迹技术是 利用各种物理方法使电泳中的生物大分子转移到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane, NC)等各种膜上，使之成为固相化分子。Southern 印迹杂交 (Southern blotting) 是将电泳分离的待测 DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。用于DNA定性、定量分析。 PCR 技术是体外快速扩增特定基因或 DNA 序列最常用的方法。 整个反应包括 DN

6、A解链 （变性）、引物与模板结合（退火）、DNA合成（延伸）三步，此三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链 DNA 分子数，理论上的最高值应是 2n。 SNP（单核苷酸多态性） 指基因组 DNA 序列中由于单个核苷酸（A，T，C 和 G）的突变而引起的多态性。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。完全基因敲除 指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除 指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因

7、敲除。基因敲除意义 研究基因功能 转基因动物的制备 用于药物筛选的动物模型 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物基因工程载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代。克隆质粒载体特点分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。穿梭质粒载体（ shuttle

8、 plasmid vector ）指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体限制性内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制修饰系统。 病毒DNA进入宿主细胞后会被降解，而宿主自身的DNA却不发生改变，这就是限制-修饰现象。 主要原因是宿主体内存在甲基化酶，该酶可特异的修饰宿主自身的DNA，防止被降解；而病毒DNA则不被修饰。影响限制酶活性的因素1）“星”活性2）甲基化3）底物性状4）试剂 同裂酶 又称为异源同工酶。指来源不同，但识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。 限制性内切酶的识别序列

9、不完全相同，但切割DNA后产生相同的粘性末端，称同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。基因多态性可表现为药物代谢酶的多态性，药物转运体(影响药物的吸收、分布和排泄)的多态性以及药物作用受体或靶点(如-肾上腺素能受体)的多态性。这些多态性导致了许多药物疗效和不良反应的个体间差异。细胞色素P450酶系(cytochrome p450, CYP450)由一群基因超家族编码的酶蛋白组成。它参与临床上90%以上的药物代谢，P450基因多态性是造成不同个体药物代谢差异的基础。涉及体内大多数药物代谢的CYP主要有3个基因家族CYP1、CYP2、CYP3。 影响目的基因与载

10、体之间连接效率的因素DNA片段间的连接方式目的基因与载体DNA的浓度比例连接温度与时间其他因素：连接酶纯度、反应缓冲体系等 影响细菌转化频率的因素 转化DNA的浓度、纯度和构型转化细胞的生理状态经CaCl2 处理后的成活率转化环境：温度MgCl2转化：Mg+对于维持DNA稳定性方面，可能起到重要的作用。提高外源基因表达水平的措施1提高翻译水平调整SD序列与ATG之间的距离 用点突变的方法改变某些碱基增加mRNA的稳定性 2 使细菌的生长与外源基因的表达分开 将宿主菌的生长和外源基因的表达分成两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷最常用的一个方法。一般采用温度诱导或药物诱导。 3 提高表达蛋白的稳定性

11、 表达融合蛋白 采用某种突变菌株 表达分泌蛋白 真核基因组的结构特点1每一种真核生物都有一定的染色体数目；2. 远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大；3. 真核生物基因转录产物为单顺反子；4. 有大量重复序列;5. 真核基因为断裂基因;6. 非编码序列多于编码序列;7. 功能相关基因构成各种基因家族。运用药物基因组学和遗传药理学发现和开发创新药物的优势。 识别疾病和途径基因的遗传药理学标识物，针对性地选择作用靶点 选择更好的药物候选物（早期确定候选物是否高度受基因多态性的影响，因而可减少因效应差异而带来的风险） 避免高多态性药物靶点 确定药物在人体内的代谢途径 开发药代动力学最稳定的化合物

12、识别由遗传变异引起的代谢和反应异常 避免开发安全范围小而又与遗传变异密切相关的药物 开发对遗传变异人群有针对性作用的药物 最大限度减少药物相互作用（药代酶相同底物、诱导和抑制）简述真核与原核细胞中翻译起始的主要区别。 原核细胞与真核细胞翻译起始的主要区别是来自 mRNA 的本质差异以及小亚基与 mRNA 起始密码子上游区结合的能力。原核细胞 mRNA 较不稳定，而且是多顺反子，在 IF-3 介导下。通过16S rRNA 的3末端在核糖体结合位点与小亚基直接结合后，原核细胞翻译起始复合物就装配起来了。 而在真核细胞中， 需要几种起始因子（eIF-4，4A，4B）帮助 mRNA 启动，起始复合物（

13、SIC，40S 亚基，eIF-2，GTP，Met，tRNA）才能结合（在eIF-4 和eIF-3 因子的促使下）到 mRNA 帽上。一旦结合，SIC 开始向 mRNA 下游区搜索，直到找到第一个 AUG 密码子。简述端粒酶的作用机理和功能。 答：端粒酶是一种核糖核酸蛋白酶，由 RNA 和蛋白质构成，具逆转录活性，能够以自身的结构 RNA 为模版，通过多次互补配对，延长端粒 3末端。之后合成引物，使 5端也得到延长。 功能：由于在复制过程中存在末端丢失，通过端粒酶的作用保护了染色体末端，同时使得端粒的得到延伸，防止端粒过短影响复制。DNA 修复的主要机制有哪些 答：DNA 修复主要机制有 7种：

14、 正读码机制，依靠 DNA聚合酶切除错误核苷酸，替换正确核苷酸； 错配修复系统，依靠 mut 基因编码的蛋白，特异性识别切除包含错误核苷酸的一段多核苷酸链，再由 DNA 聚合酶重新合成； 光复活作用，通过修复酶（光裂化酶）直接逆转紫外辐射造成的嘧啶二聚体结构； 碱基切补修复，糖基化酶将碱基移除，而后由核苷酸内切酶进行补切修复； 核苷酸切补修复，将受损伤的一段核苷酸切除，合成新的核苷酸替换错误片段； 重组修复，通过从受损 DNA找回序列信息来修复 DNA断裂，当 DNA两条链都受损时采用这种方式； SOS 应答，当 DNA 受到放射损伤或其它较大损伤时，形成特化的 DNA 聚合酶催化，此酶越过损伤部位直接合成 DNA阐述乳糖操纵子的组成及其调控机制。 乳糖操纵子由调控基因 lacI 、操纵基因和三个结构基因 lac Z、lacY、lacA组成。lacZ 编码-半乳糖苷酶，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖。lacY编码-半乳糖苷透性酶，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。lacA 编码-半乳糖苷乙酰转移酶，其功能只将乙酰-辅酶 A上的乙酰基转移到-半乳糖苷上。 Lac 操纵子的调控分为正调控和负调控两种。lacZ、Y、A 基因的转录是由 lacI 基因指令合成的阻遏蛋白和 cAMP 与其结合蛋白 CAP 所控制的。机体内没有乳糖时，l