与moi值的计算

1、实验四 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）一、实验目的 了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料 1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、9

2、6孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。 2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100l。3、在每孔加入细胞悬液100l，使细胞量达到23105个/ml。 4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100l生长液+100l细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法1、Reed-Muench两氏法病毒液稀释度出现CPE孔数无CPE孔数累 计

3、出现CPE孔所占的%CPE孔数无CPE孔数10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6 （11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathic effect距离比例（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） （91.6-50）/（91.6-40） 0.8lgTCID50=距离比例稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8(-1)+(-3) =-3.8TCID50=10-3.8/0.1

4、ml含义：将该病毒稀释103.8接种100l可使50%的细胞发生病变。2、Karber法病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-60 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1(3.375-0.5) =-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释103.875接种100l可使50%的细胞发生病变。什么是MOI？MOI 是multiplicit

5、y of infection的缩写，中文译为感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。而对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu表示病毒的数

6、量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles, v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量，因此其MOI就有了不同含义。采用TU或IU，MOI的含义便是TU number/cell 或IU number/cell。采用v.p.，MOI的含义便是v.p. number/cell 。采用v.g，MOI的含义便是v.g. number/cell。可以将上述不同的MOI 表示方式分为2种：1） 以活性单位表示病毒数量，如pfu, TU, IU。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。2） 以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p. 或

7、v.g. 。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因组数。值得一提的是，上述2种不同的MOI 表示方式在含义和数值上都有所不同。前一种是传统意义上的MOI，后一种MOI表示方式的含义更为简化和直观，也逐步被一些研究者采用。传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。其公式为：P(k) = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。其中：P(k) 为被感染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中99%的培养细胞，则

8、：P(0) = 1% = 0.01m = -In(0.01)= 4.6 pfu/cell。由此可以看出，由于病毒特性和研究者习惯的不同，MOI的单位由原来约定俗成的pfu number/cell变成多种表示单位。在阅读文献和写作论文时，应注意MOI的具体含义和单位。MOI=（pfu/ml的值）乘（取的病毒液体积）再除以你要转染的细胞数。TCID50与 PFU换算: PFUs0.7TCID50的滴度PFU:plaque forming unit，空斑形成单位。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因

9、此建议也可使用TCID50法。Sample problem:You infect a monolayer of 1X107 cells with 0.1 ml. of a sample of virus the titer of which is 1X 109 PFU/ml.What is the MOI of this infection, and how many cells are infected?0.1ml. ( 1 X 109 PFU/ml ) = 1 X 108 PFUMOI = PFU/cell =1 X 108 / 1 X 107 =10The proportion of i

10、nfected cells = 1- the proportion of uninfected cells = 1-e-m =1-e-10 =0.999952The number of infected cells = the total number of cells multiplied by the proportion of infected cells = (1X107) (0.999952) = 0.999952X107. Thus at an MOI of 10, most cells are infected.Now you calculate the number of ce

11、lls that are uninfected, infected with one PFU, and multiply infected.The One-step growth curve was devised by Ellis and Delbruck to study the single cell life cycle of bacteriophage. The key element of this experiment is synchronization of the infected cells so that the population reflects events o

12、ccurring in the single cells. Synchronization is achieved by infecting the culture of cells at an MOI at which most of the cells are infected (MOI of 5-10). At various times aliquots of the infected culture are withdrawn and assayed for PFU by plaque assay. Samples can be tittered directly, or lysed

13、 prior to analysis to observe intracellular events. Refer to your text for a graphic plot of the curves. Pay special attention to the events in the life cycle of a virus (eg. Adsorption, uncoating, biosynthesis, assemble, release) that occur in the latent, eclipse, exponential rise, and plateau regi

14、ons of the curve. From the total number of cells in the culture, and the total number of progeny PFU produced at the end of the rise (“burst”) one can calculate the number of PFU produced per cell.-MOI, pfu, and TCID50 Plaque forming units (pfu)is a measure of number of infectious virus particles. I

15、t is determined by plaque forming assay. Multiplicity of infection (moi)is the average number of virus particles infecting each cell. TCID50is the tissue culture infectious dose which will infect 50% if the cell monolayers challenged with the defined inoculum. If the titer is 103TCID50/0.2 ml, MK, 2

16、 days, it means that when a 0.2 ml inoculum of a 1:1,000 dilution of the virus is added to each of four tubes containing monkey kidney (MK) cells, two tubes are expected to become infected.MOI is related to pfu by the following formula:Multiplicity of infection (moi) = Plaque forming units (pfu) of

17、virus used for infection / number of cells.For example, if 2x106cells is infected by 50ml of virus with a titer of 108pfu/ml. The moi will be 0.05*108/2*106= 2.5.The fraction of cells that are not infected isP(0) = 1 - e-moi,i. e., 8% for moi = 2.5.To ensure 99% of cells are infected requires moi 4.

18、6.Assume the conditions used for plaque assay and TCID assay dont alter the expression of infectious virus, TCID50/ml and pfu/ml are related bypfu/ml = 0.7 * TCID50.As a working estimate, one can usepfu/ml = 0.5 * TCID50.H5N1流感病毒TCID50（组织半数感染量）测定一 生物材料与试剂1.病毒与细胞高致病性H5N1禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/35/201

19、1（以下简称：YZ35）MDCK细胞2.培养基10%DMEM、无血无抗DMEM、1%DMEM3.其他96孔板、血凝板、PBS、1%的鸡红细胞二 操作步骤1. 细胞准备取出一块96孔细胞培养板，每个孔大约传800010000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10mL培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约70-90丰度即可接种病毒（晚上传好板第二天早上就能用）。2. 稀释待测病毒YZ35尿囊液YZ35尿囊液用无血无抗的DMEM进行10倍倍比稀释，即向每支EP管中加入900L无血无抗的DMEM，向1号试管中加入100L病毒尿囊液，振荡混匀，再从1号管中取100L稀释液依次10倍

20、系列稀释至10-10。注意：（1）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。（2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。3.病毒稀释液接种细胞取细胞培养板，用多道加样器（即排枪）吸去96孔板中的培养液，再吸取无血无抗DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100L，每个稀释度做8个重复（即1竖排）。根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度加样。同时设置正常的细胞对照16孔（即2竖排）。37CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入1%DMEM维持液200L继续在37 CO2培养箱中培养。注意：低致病性流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2g/mlTPCK-胰酶。