玉米粉淀粉含量近红外模型建立与优化

1、玉米粉淀粉含量近红外模型建立与优化韩洁楠1，王美娟1，赵训超1,2，鲁鑫1，周志强1，李明顺1，张德贵1，郝转芳1，翁建峰1，雍洪军1，李新海1（1中国农业科学院，作物科学研究所，北京 100081；2黑龙江八一农垦大学，农学院，黑龙江 大庆，163319）摘要淀粉是玉米产量和品质的重要性状，在群体水平准确测定淀粉含量是研究淀粉遗传与生理的重要基础。本文以230份玉米自交系为样本，采用旋光法与一阶导数及去一条直线的光谱预处理法，构建玉米粉样淀粉含量的近红外分析（NIRS）模型，可显著提高籽粒淀粉含量预测的准确性。该模型的定标标准偏差（RMSEE）、交叉验证标准偏差（RMSECV）、外部验证标准

2、偏差（RMSEP）、定标相关系数（R2cal）、交叉验证相关系数（R2cv）、外部验证相关系数（R2cv）分别为0.609、0.722、0.738、0.909、0.864和0.854。建立的玉米粉样NIRS模型可将预测值与化学值偏差控制在1.7%内，能够准确定量分析玉米籽粒淀粉含量，应用于育种材料早期筛选及群体水平粗淀粉分析。关键词：玉米粉；淀粉含量；近红外分析模型；准确度Establishment and Optimization of a Near-Infrared Model of Maize Starch ContentJienan HAN, Meijuan WANG, Xunchao

3、 ZHAO, Xin LU, Zhiqiang ZHOU, Mingshun LI, Degui ZHANG, Zhuanfang HAO, Jianfeng WENG, Hongjun YONG, Xinhai LIAbstract Starch content is an important trait of maize (Zea mays L.) kernels as it accounts for the seed yield and quality. Analysis starch content accurately at the population level is the i

4、mportant foundation when we study genetic and physiological of starch quality. In this paper, 230 maize inbred lines were set as samples, using the method of polarimeter and pre-treatment of the first derivative add minus one line separately to establish and optimize a Near-infrared spectroscopy (NI

5、RS) model of maize starch content successfully, which can improve the accuracy of the prediction significantly. Of the model, the calibration standard deviation (RMSEE) is 0.609, the cross-validation standard deviation (RMSECV) is 0.722, the external verification standard deviation (RMSEP) is 0.738,

6、 the calibration correlation coefficient (R2cal) is 0.909, the cross-validation correlation coefficient (R2cv) is 0.864, and the external verification correlation coefficient (R2cv) is 0.854. Of the model, the deviation between the predicted value and the chemical value can be controlled within 1.7%

7、, which can improve the accuracy largely when it was used in quantitative analysis of grain starch content and then can be applicated in breeding inbred line selection or crude starch content analysis at the group level.Key words: Maize kernel powder; Starch content; Near-Infrared spectroscopy (NIRS

8、) model; Accuracy基金项目中国农业科学院科技创新工程-主要农产品营养品质评价与调控（2019-2023年）作者简介韩洁楠（1990-），女，河北省石家庄，助理研究员，主要从事玉米籽粒淀粉品质遗传改良与种质创制。TelE-mail：hanjienan1 前言淀粉是玉米籽粒胚乳的主要组成部分，约占籽粒70%的干重。淀粉积累量与籽粒饱满度及产量呈显著正相关，同时总淀粉中支链淀粉及直链淀粉比例和结构影响籽粒的品质。2018年我国玉米总产量达到2.57亿吨，种植面积4213万公顷，是我国种植面积最大、总产量最高的作物（国家统计局，2018年）。目前，玉米品种需求

9、已从传统产量型向品质型、专用型转变，例如近年来发展起的玉米淀粉、燃料乙醇、氨基酸加工等。玉米制取淀粉原料充足、出粉率高、工艺成熟、生产成本低、产量高、不受季节限制，是最具工业化生产淀粉的谷物原料。目前以玉米淀粉为原料生产的工业制品达千余种，其广泛用途可与石油类产品相提并论1。我国主推玉米品种淀粉含量随着年代变化总体呈上升趋势，每10年上升约0.25% 2，平均淀粉含量低于发达国家。淀粉合成途径关键基因的改造或调控是提高玉米淀粉含量的有效途径，可显著加快高淀粉玉米等专用型品种培育进程3-6。玉米种质资源丰富，淀粉含量差异大7-8，因此构建重组自交系群体或收集自交系群体，采用联合连锁不平衡分析（Q

10、TL）及全基因组关联分析（GWAS），是正向发掘淀粉含量调控因子及优良单体型的重要途径。QTL定位发现，调控淀粉含量的QTLs遍布玉米的10条染色体9。Wang分析CI7/K22重组自交系群体发现6个QTLs位点分别解释4.7%-10.6%淀粉含量差异，7个候选基因中4个基因参与淀粉合成，3个基因编码非淀粉代谢途径酶类10。Cook等发现了多个玉米籽粒淀粉、蛋白及油分调控基因7。Liu等对263份自交系全基因组联合分析，发现77个候选基因与淀粉含量相关，其中包括淀粉合成关键酶AGPase的亚基APS18。Xiao等对B73 x DHLoPro1 F2:3群体QTL定位发现qHS3位点，可以解释

11、26%的淀粉差异11；该位点在三个连锁群体中均被发现12-14；利用此位点差异的近等基因系进行转录组测序，发现76个基因发生突变，384个基因差异表达，进一步分析认为催化葡萄糖转化为6磷酸葡萄糖的己糖激酶ZmHXK3a为靶基因11。Li等对454份自交系玉米进行GWAS分析，发现27个位点调控直链淀粉含量，候选基因包括转录因子、糖基转移酶、糖苷酶、水解酶等15。淀粉合成通路复杂，仍需进一步精细定位关键调控基因，解析基因功能。总淀粉测定常用的化学方法有旋光法、比色法、酶解法、酸解法等16。化学方法测定过程繁琐、成本高、耗时长，需要配置特定的仪器，不适合大规模群体水平的测定。20世纪50年代，近红

12、外光谱分析（near infrared spectroscopy, NIRS）技术首先应用于农产品的品质检测与分析，使NIRS技术在农业相关领域的应用研究陆续展开17。该技术通过将化学测定值与光谱数据建立数学模型，运用特定仪器扫描样品获得光谱数据，便可快速获得样品定量或定性检测结果。NIRS法测定玉米淀粉含量已入选国标法18。近红外光是指波长介于可见光与中红外光之间的电磁波，近红外光照到样品的内部，发生反射、折射、吸收等相互作用，使光传播方向不断变化，最终携带样品信息反射出样品表面被检测器接收，这种漫反射光谱采集方式是颗粒、粉末状等复杂样品无损快速测定的形式19。玉米籽粒形态不规则，例如马齿型

13、呈扁平状，有明显的具胚平面和无胚平面。研究发现玉米胚正对近红外仪器光源时，采集的光谱包含大量胚的信息，胚背对光源采集到的光谱大部分信息则来自胚乳20。玉米籽粒中98%的淀粉积累在胚乳中，完整籽粒装样时很难保证胚的朝向，造成预测偏差较大。为了增加光谱携带信息，研究者倾向于将具胚面朝向光源，导致预测结果偏低。完整籽粒装样，籽粒之间的孔隙大，当对样品进行扫描时，近红外光会穿过籽粒间孔隙，造成能量损失，进而影响光谱信息的准确度。玉米籽粒形状、大小、颜色等性状会因种植年份和地区的不同而变化，使得光谱通用性也面临严峻挑战。应用NIRS法分析茶叶中粗纤维、水分及灰分，发现当样品颗粒度为 0.5 mm 时，标

14、准偏差更低，值也较稳定21。刘建学采用精米粉建立NIRS蛋白质含量预测模型，相关系数达0.94，通过对不同粒度米粉分析，发现样品粒度越小，所建模型的预测性能越好22。罗曦以水稻米粉为样品建立了水稻抗性淀粉含量预测模型，内部验证及外部验证都具有较高的相关系数（0.97、0.98），定标模型精度更高，误差更小23。邵春甫以粒径约为0.15 mm的高梁粉，建立总淀粉、直链淀粉以及支链淀粉NIRS模型，相关系数分别达到0.95、0.92以及0.94，模型精度高24。宋瑜采用小麦粉建立灰分预测模型，预测值与真值之间的相关系数为0.94，同样的样品处理方式比拉曼光谱分析技术建立的模型预测精度高25。刘会影

15、建立NIRS法测定玉米秸秆粉样中纤维素和半纤维素含量模型，预测平均相对误差仅为2.34%和2.13%，预测值与化学值误差较小26。已有报道均是针对玉米完整籽粒建立的NIRS总淀粉预测模型，预测精度及适用性较低。因此本研究旨在建立以玉米籽粒粉为样品的NIRS预测模型，在保证快速、高效前提下进一步提高总淀粉预测精度，实现对群体水平样本量的快速准确测定。2 材料与方法2.1试验材料及田间试验以230份高配合力玉米自交系为材料，包括美国NSS群、美国SS群，中国NSS群、中国SS群、中国旅大红骨群、中国四平头群， 为1982年至2016年我国主要的育种材料对这230份供试自交系的代表性加以描述。201

16、8年种植于吉林省公主岭中国农业科学院作物科学研究所基地。采用不完全随机区组设计，3次重复，自交授粉。行长4 m，行间距0.6 m，株距0.26 m，种植密度为6.4万株/hm2。2.2淀粉测定每次重复挑选长势一致的三个单穗混合，剔除不完整的籽粒。利用小型电动磨粉机磨样，充分粉碎籽粒样品，过50 mm网筛，鼓风干燥烘箱65度将玉米粉水分烘干至2%以下，保存备用。采用快速水分测定仪（YGS-101）测定水分（H）。参照国标方法旋光法（GB 5009.9-2016）测定谷物籽粒淀粉。具体操作为：油浴分解。为保证含水量在2%以内，称样前利用65度烘箱再次干燥样品4-6 h。称取2.5000±

17、0.05 g（W）干粉，放入250 mL三角瓶中，加入20 mL氯化钙-乙酸溶液（pH=2.0）涡旋混匀，充分溶解样品, 再加入20 mL氯化钙-乙酸溶液，冲洗容器壁。置于120度甘油浴锅中，持续加热30 min，取出后自来水冲洗冷却至室温。待测液制备。将溶解液全部转入100 mL容量瓶，加入1 mL 硫酸锌溶液（30%, W/V），摇匀，加入1 mL 亚铁氰化钾溶液（15%, W/V），摇匀，蒸馏水定容至100 mL。定量滤纸过滤，滤液即为待测液。上机测定。零点调整用氯化钙-乙酸溶液：蒸馏水（6:4）。用待测液润洗旋光管两次，在20度恒温条件下测定相对旋光值（，AUTOPOL III旋光仪）

18、。计算公式。粗淀粉含量（%）=*106/203*LW（1-H）。每个样品平行测定两次，相对误差不超过2%。含水量H平均为1%，管长L为10 cm。该试验在玉米优质抗逆育种创新组实验室完成，玉米标准样品（71.67%）由农业部谷物品质监督检验测试中心提供。平均每5天测定标样一次，测定值与标准含量相比偏差均小于1.5完成标准方法化验的实验室是哪？是否是具备国家部门认可的标准化实验室？完成后的模型分析出的样品数据是否又由具备国家标准资质的实验室检测？偏差多少？本研究用的230份自交系（分为定标集及测试集），全部应用该方法测定淀粉的准确含量。以标准样品为校正样品，本实验室测定结果与农业部谷物品质监督检

19、验测试中心测定结果偏差小于1.5%，测定结果准确可靠。%，测定结果准确可靠。 本研究230份玉米自交系群体，淀粉含量最高为73.63%。用该模型分析的淀粉含量若超过该阈值，我们会运用旋光法进一步测定其准确含量，同时收集光谱不断完善扩大该模型的应用范围淀粉含量最高为73.63%以上的测试结果会受多大偏差？应用时如何规避？。2.3 玉米粉样NIRS法光谱分析样品处理与旋光法分析样品一致。在采集光谱前，所有粉样在65度下再次平衡水分4-6 h，每批样品随机抽取20个进行水分测定，确保水分含量全部在2%以内。装入直径为2 cm，高5 cm的西林瓶中，样品高度约4 cm，镇压匀实以保证各部分密度一致。每

20、份样品装样1次，每次装样扫描2次，采集全光谱数据保存。近红外光谱仪器为MPA 型傅立叶近红外反射光谱仪（德国BRUKER 公司），谱区范围4000-12000 cm-1，扫描次数64，分辨率8 cm-1。2.4 NIRS预测模型建立与验证近红外谱区范围采用交互式选择法确定。在收集样品近红外光谱时，一些噪音信息会进入到光谱图中，影响玉米淀粉分析，也直接影响预测值的可靠性和准确性。因此，在获得光谱图时，运用多种数据预处理方法，最大限度提高光谱数据预测值与真值间的相关性。OPUS 6.5提供了多种预处理函数，包括无光谱处理、消除常数偏移量、减去一条直线、矢量归一化、最小-最大归一化、多元散射校正、一

21、阶导数、一阶导数及减去一条直线、一阶导数加矢量归一化。光谱预处理后利用偏最小二乘法（PLS）对淀粉化学测定值与近红外光谱数据拟合并建立模型，具体包含两步操作：1）利用定标集样品建立校正模型，并做交叉检验；剔除异常值优化模型。2）利用测试集样品进行外部检验。2.5统计分析方法试验数据采用Excel (2016版) 和SAS 软件进行分析处理，包括方差分析、相关分析等。3 结果与分析3.1供试样品淀粉化学法分析对230份供试自交系玉米粉样进行粗淀粉含量百分比测定，结果表明粗淀粉含量最高为73.63%，最低为59.85%，平均值为67.62%，分布频率如图1所示。本研究中玉米种质材料收集于1982年

22、起至2016年国内应用广泛的育种自交系，粗淀粉含量涵盖了当前育种材料的范围。 图1 粗淀粉含量分布频率直方图 Figure 1 Crude starch content distribution frequency of maize inbred lines3.2玉米全粒粉近红外光谱图将玉米粉在短波近红外区进行全光谱扫描（如图2所示）。结果发现不同样品曲线线型相似，表明玉米自交系籽粒基本成分相对一致，样本间的光谱差异则标志着籽粒中各成分百分含量有差异。平行样品的吸收峰基本重叠在一块（相同颜色），说明同一样品不同生物学重复光谱的重现性好。 图2 四份随机样品的近红外漫反射光谱示意图 Figure

23、 2 Schematic diagram of near-infrared diffuse reflectance spectra of four random samples3.3 玉米粉NIRS模型的校正与优化NIRS法需要建立精度高、有代表性的预测模型，建模样品集的合理性、化学含量测定的准确性直接影响预测结果精确度。按照分析方法2.3，获得230份玉米交系全粒粉样准确淀粉含量。供试样品随机编号排序，淀粉含量分布均匀，利用MAP配套分析软件OPUS 6.5按比例50%自动选择建模样品。主成分分析显示定标样品粗淀粉含量覆盖95%以上供试材料，具有代表性。利用OPUS6.5计算所有样品的F概率

24、，F>0.99时显示为红色，表明该样品光谱异常或真值有误，导致预测值与真值间差异较大，予以删除。通过内部交叉验证，验证模型的准确度，同时去除离散性大的样品。计算表明马氏距离GH0.4的样品可视为来自同一群体，GH0.4的样品则视为异常样品予以剔除。本研究最终以106份样品为定标集，建立玉米粉NIRS预测模型。定标集淀粉含量最高为73.63%，最低为62.35%，平均为67.73%，标准差2.01，淀粉含量频率分布直方图如图3，化学值变化范围为11.28%，变异程度较高，基本覆盖自交系籽粒淀粉质量分数变化范围，满足建立NIRS模型条件。图3定标集淀粉含量频率分布直方图Figure 3 St

25、arch content distribution frequency of calibration samplesNIRS法预测精确度与NIRS模型直接相关，相关系数R2和均方根误差RMSE是评价预测模型好坏的主要参数，高精度预测模型应具有较高R2和较低的RMSE。剔除全部异常样品，以一阶导数加减去一条直线的最优预处理函数对光谱进行预处理，利用偏最小二乘法（PLS）建立的NIRS预测模型精度最高。标准偏差（RMSEE）为0.609，交叉验证标准偏差（RMSECV）为0.722；定标相关系数（R2cal）为0.909、交叉验证相关系数（R2cv）为0.864（如图4）。相关系数、标准差满足NI

26、RS模型对准确度的要求，可应用于定量检测分析。图4 玉米粉样NIRS淀粉预测定标模型 Figure 4 Starch content predication model of NIRS of maize kernel powder3.4 玉米粉NIRS模型的预测效果分析进一步通过外部验证分析NIRS预测模型的精度，外部验证所用的样品未参加模型建立，分析预测值和化学值之间的符合程度可评价本模型的预测效果。同样根据F得率剔除部分光谱异常或化学值异常样品后，外部验证集由94份样品组成，淀粉含量最高为71.99%，最低为60.41%，平均值为67.62%，标准差1.92。外部验证标准差（RMSEP）为

27、0.738，相关系数（R2cv）为0.854（图5）。分析发现预测值与旋光测定值偏差均在1.7%以内，经单因素方差分析两值无显著差异，表明该预测模型精度较高，可应用于玉米粉淀粉含量的定量分析。图5 NIRS模型的外部验证结果Figure 5 External validation results of NIRS model 4 讨论应用NIRS技术快速扫描样品，可获得农产品水分、灰分、淀粉、直链淀粉、蛋白质、油分、脂肪、多糖、单糖等含量，方便快捷，被广泛应用于品质的定量和定性分析27-31。玉米自交系平均淀粉含量在67-68%之间，处于较高水平。Xiao等选取的近等基因系淀粉含量仅相差2.8%

28、11。玉米种质资源丰富，粒型多变，有硬粒型、马齿型、中间型、粉质型等；籽粒形状有圆形、楔形、中间型，大小也各不同，籽粒形态特征的差异会导致完整籽粒NIRS预测准确度降低32，而籽粒磨粉后颗粒均一，装样紧实，可显著提高光谱稳定性，使NIRS预测偏差大幅降低。本研究建立的模型预测偏差小于1.7%，预测值与化学值无显著差异。基因共表达分析、转录组分析法可快速、高效发掘相关性状候选基因9，因此群体水平个体性状的精确分析始终是限制因素。玉米群体一般成百上千份，数量大。NIRS法能快速获得定量或定性数据，但由于稳定性低通常需要多年多点的数据综合分析7-9，除环境气候条件对生长发育影响外，NIRS法预测偏差

29、大是主要原因。研究发现NIRS可靠性的增加，会使稳定性降低。刘林三等通过分割建模的方式，来提高对完整籽粒直链淀粉的预测精度33。本文建立的玉米籽粒粉样淀粉NIRS模型，预测值与真值无显著性差异，与完整籽粒快速无损检测相比准确度更高，所需样品更少。按上机分析时每样装样1次计算，平均只需8.24 g干样，约25粒干种子（未发表数据）。水分含量对淀粉含量影响大，若准确分析完整籽粒水分含量则费时费力，若常温平衡水分则需花费较长时间。籽粒粉样水分可快速烘干、精确检测，本文中用鼓风干燥箱烘干玉米粉样只需12小时，含水量更低的粉样NIRS预测值也更接近绝对含量。但本文中建立模型所用样品的淀粉含量范围较窄，对

30、于含量低于60%及高于74%的样品预测稳定性较低，需进一步搜集玉米材料完善预测模型范围。5 参考文献1 张涛. 玉米淀粉深加工技术及产品用途J. 农牧产品开发, 1998, 32-34.Zhang T. The deep processing technology of corn starch and application of starch product. Agricultural and Animal Product Development, 1998, 32-34. (in Chinese)2 孙琦, 张世煌, 李新海等. 中国不同年代主推玉米品种品质性状的变化趋势J. 中国农业科学

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